Наш метод позволяет изучать кровеносные сосуды, расположенные в структурах, которые в противном случае было бы трудно изображение в Vivo, таких как гиппокамп. Поскольку кровеносные сосуды удаляются из ткани мозга, сигнализация между капиллярами и артериолом может быть изучена без нецелевых воздействий на окружающие ткани. Чтобы изолировать гиппокамп, используйте небольшие ножницы для вскрытия, чтобы сократить кожу вдоль средней линии в верхней части головы мыши и переместить кожу в стороны.
Начиная с хвостовой стороны черепа, вырезать череп вдоль средней линии, пока обонятельные луковицы не будут достигнуты и удалить части черепа, пока головной мозг подвергается. Начиная с носа мыши, медленно удалить мозг, используя ножницы, чтобы прорезать обонятельные луковицы, черепные нервы и спинной мозг. Погрузите мозг, брюшной стороной вниз в MOPS Buffered Saline, в центре пластины вскрытия, и поместите пластину под микроскопом вскрытия.
Удерживая острый край параллельно нижней части блюда, используйте лезвие бритвы, чтобы разрезать мозг пополам вдоль продольной трещины одним ударом. Поместите одно полушарие в центре пластины с средней линией лицом вниз и нажмите лезвие бритвы прямо через ткань вдоль поперечной трещины, чтобы удалить мозжечок и ствол мозга. Поверните полушарие так, чтобы медиальная сторона была обращена вверх и используйте шпатель, чтобы держать мозг на месте.
Вставьте кончик второго шпателя под корпус мозоли, черпая под тканью, чтобы удалить таламус, перегородку и гипоталамус из гиппокампа. Гиппокамп теперь должен быть виден как изогнутая структура вблизи задней стороны головного мозга. Используя один шпатель, чтобы держать мозг на месте, используйте второй шпатель, чтобы зачерпнуть гиппокамп из головного мозга.
Затем перенесите гиппокамп на новую пластину вскрытия, заполненную примерно на полпути свежим раствором MOP. Для изоляции гиппокампа артериола, поместите небольшие булавки на каждом конце одного гиппокампа, чтобы обеспечить образец гиппокампа артерии сторону вверх. Используя очень острые типсы, аккуратно растягивайте небольшие участки гиппокампа, чтобы ослабить ткань, окружающую артериолы.
И поиск через спинной гиппокампа тканей для выявления внешних поперечных артерий. Когда артерия была расположена, захватить внешнюю поперечную артерию из гиппокампа и медленно вытащить его из ткани, чтобы собрать артериолы и капилляры. Артерия из каждого гиппокампа удаляется отдельно.
Когда больше не будет сосудов, которые необходимо удалить, поместите образцы на лед и отбросьте оставшуюся ткань гиппокампа. Для канюкуляции артериол, найти и arteriole с ветвью, которая заканчивается капилляров и место arteriole в органную камеру. Тщательно нажмите кончик канюли через стенку arteriole ниже целевой области, чтобы смонтировать кровеносный сосуд.
Затем осторожно сдвиньте сосуд на канюлю, пока не будет достаточно ткани, на которой можно разместить галстук. Используйте 12-0 нейлоновых швов, чтобы сделать свободный узел, который будет соответствовать над кровеносным сосудом и канюлей, и использовать половину заминки узел для обеспечения связей, тянуть концы, чтобы затянуть узел, чтобы обеспечить arteriole к канюле. Закретте другой галстук на другом конце артериола, чтобы запечатать его.
На противоположной стороне камеры опустите вторую канюлю до тех пор, пока точка канюлы не приколоет галстук на конце артериола. Затем используйте третью канюлю, чтобы прикрепить капиллярную ветвь к крышке, поместив кончик близко к концу ветви, оставляя концы капилляров открытыми. Поскольку микроциркуляция мозга изысканно хрупкая, не забудьте свести к минимуму растяжение и обработку сосудов во время процедуры каннюляции, чтобы обеспечить выживание артериол.
Для анализа миографии давления перенесите камеру на сцену светового микроскопа с помощью программного обеспечения для записи и соедините приток и отток труб в камеру для изобилия. Начните изобилие с 37 градусов по Цельсию Искусственная спинномозговая жидкость на четыре миллилитра в минуту скорости потока, и приложите давление канюли перистальтического насоса в паре с давлением преобразователя. Доввейте внутреннее давление до 20 миллиметров Меркурия и запустите программное обеспечение для записи.
Отрегулируйте микроскоп и настройки изображения, чтобы получить максимально четкое изображение. И используйте программное обеспечение Edge Detection, чтобы проверить, что arteriole составляет около 15 до 30 микрометров в диаметре, когда он полностью расширен. После оптимизации настроек начните запись и увеличьте внутрисосудийное давление в сосуде до 40 миллиметров Меркурия, записывая диаметр артериола с помощью программного обеспечения Edge Detection.
Затем обильное камеру в течение 15 до 20 минут, чтобы вымыть раствор MOP. Чтобы проверить жизнеспособность сосуда, применить один раствор микромолара NS309 к изобилию ванны, артериолярный сегмент должен расшириться, демонстрируя 30-40%миогенный тон. После того, как базовый тон для arteriole была создана, использовать стеклянный шкив, чтобы сделать канюли с тонкой точкой на одном конце, и использовать типсы, чтобы сломать кончик каждой канюли, так что препарат интерес может плавно течь через кончик на пять фунтов давления на квадратный дюйм.
Заполните канюлю препаратом, представляющим интерес. И загрузите канюлю на трехосевой микроманипулятор, прикрепленный к микроскопу. Соедините трубки от системы выброса давления к канюле и медленно опустите канюлю в ванну возле капилляров, заботясь о том, чтобы не попасть ни в какую часть сосуда или камеры.
Чтобы стимулировать капилляры, опустите канюлю на крышку рядом с капиллярами и активируйте систему выброса давления с желаемым временем выброса. В конце стимуляции, поднять канюлю немного, чтобы избежать дальнейшей стимуляции. Чтобы подтвердить, что стимулируются только капилляры, заполните новую канюлю одним микромолярем раствора NS309 и стимулировать капилляры, как это было продемонстрировано.
Затем получить максимальное вазодилатации путем купания препарат с раствором без кальция. Ванна применения одного микромолара NS309 вызывает почти максимальное расширение артериола из-за кальция чувствительных каналов калия в эндотелии. Капиллярные эндотелиальные клетки, однако, отсутствие промежуточных и малых каналов проводимости и не гиперполяризируются в ответ на агонист, в результате, стимулируя капиллярные концы с NS309, не вызывает вверх по течению артериолярного расширения, это указывает на то, что NS309 не достиг артериола, и может быть использован в качестве контроля для доступа к спациального ограничения соединения применяется на капилляры путем выброса давления.
Использование гиппокампа капиллярных паренхимальных arteriole подготовки, как попродемонстрировано, применение искусственной спинномозговой жидкости, дополненной 10 миллимолярной калия в капиллярных концах, приводит к вверх по течению артериолярного расширения, которое не отличается между препаратами от мужчин и самок мышей. Кроме того, добавление ингибитора Kir2 ML 133, практически отменяет капиллярное индуцированное расширение артериоляров, в ответ на 10 миллимолярия калия в препаратах от мышей мужского и женского пола. При монтаже крови vesssel, ограничить прямое взаимодействие с кровеносным сосудом, чтобы свести к минимуму ущерб, и увеличить жизнеспособность сосуда.
После того, как кровеносный сосуд был изолирован, различные соединения наркотиков могут быть проверены или кровеносный сосуд может быть дополнительно обработан для олекулярной биологии, иммунохимии или электрофизиологических исследований.
