Целью этого видео является описание модели культуры органов роговицы человека Descemet's Stripping Only с ускоренным заживлением, стимулируемой инженерным фактором роста фибробластов. Эндотелиальная дистрофия роговицы Фуха, или FECD, является заболеванием, характеризующимся потерей насосной функции в эндотелиальных клетках роговицы и чрезмерным накоплением коллагена и других белков внеклеточного матрикса на поверхности мембраны Descemet, образуя роговицу guttae. Единственным известным методом лечения FECD является эндотелиальная кератопластика в различных формах, все из которых сопряжены с риском отторжения и потери эндотелиальных клеток.
В то время как достижения в офтальмологической хирургии позволили этим процедурам стать менее инвазивными с течением времени, любая форма трансплантации сопряжена с риском отторжения и возможностью пожизненного использования стероидов. Descemet's Stripping Only, или DSO, является экспериментальной альтернативой, в которой пациенты с FECD с гуттами, локализованными в центре роговицы, удаляют центральный четырехмиллиметровый круг мембраны Descemet без замены трансплантата. Удаление гутт стимулирует здоровые периферические клетки мигрировать внутрь и реформировать эндотелиальный монослой, в конечном итоге обращая вспять стромальный отек и улучшая зрение.
Хотя у этого метода есть много преимуществ, процесс заживления длительный и непоследовательный, и некоторым пациентам требуется спасательная трансплантация, если в течение месяца после операции не наблюдается заживления. Лечение, которое стимулирует более быстрое заживление ран после DSO, может сделать процедуру более осуществимым вариантом для пациентов с FECD. Этот протокол моделирует клиническую процедуру DSO в формате культуры органов с использованием донорской роговицы человека с целью тестирования методов лечения для улучшения заживления ран после DSO, чтобы сделать DSO более осуществимым вариантом для пациентов с FECD.
Наша лаборатория использует эту модель для тестирования заживления ран в роговицах, обработанных сконструированным фактором роста фибробластов, для которого мы покажем репрезентативные результаты позже в этом видео. В этой части процедуры будет использоваться биопсийный удар, чтобы отметить четырехмиллиметровую область раны, из которой будет удалена мембрана Descemet. Используя стерильные щипцы, удалите роговицу из среды и промойте в 1X PBS для удаления остаточных сред и клеточного мусора.
После полоскания поместите эндотелиальную сторону роговицы вверх на крышку чашки Петри. Окуните новый четырехмиллиметровый биопсийный перфоратор в трипан-синий в сварную посуду и снимите излишки. Обеими руками расположите перфоратор над центром роговицы и опустите его прямо на эндотелиальную поверхность, оказывая минимальное давление.
Без изменения положения или давления на роговицу переложите удар на одну руку и потянитесь за щипцами только что свободной рукой. Используйте щипцы, чтобы удерживать роговицу на месте, осторожно скручивая биопсийный удар примерно на 90 градусов вперед и назад несколько раз. Поднимите биопсийный удар прямо из роговицы и отложите в сторону.
Смойте еще раз в 1X PBS, чтобы удалить лишний трипан синий. Переложите роговицу на крышку чашки Петри в рассекающий прицел. Удерживая роговицу на месте изогнутыми щипцами, Десцемет слегка перетаскивая кончик острой 30-калибровочной иглы вдоль кольца трипан-синего цвета, оставленного ударом биопсии.
Используйте минимальное давление, чтобы избежать разрушения подлежащей стромы. С помощью крючка sinskey используйте мягкие зачерпывающие движения, чтобы поднять и отклеить мембрану Descemet вокруг края раны. Работа в направлении центра поражения.
Мембрана Descemet должна иметь очень малое сопротивление. Если вы испытываете трудности, вы, вероятно, подтягиваете строму. Если это произошло, начните сначала, поднимая из новой точки по краю раны.
После того, как большая часть мембраны Descemet была отделена от стромы, используйте щипцы Gorovoy, чтобы удалить мембрану и отложить в сторону. Осмотрите зачищенный участок на предмет остатков мембраны и удалите горовыми щипцами. После зачистки Descemet окрашивают роговицу трипаном в синий цвет, чтобы визуализировать область раны.
Промыть роговицу в 1X PBS, содержащем 0,01% хлорида кальция и хлорида магния, чтобы удалить клеточный мусор, который может взаимодействовать с трипан-синим и способствовать плотному прилипанию оставшихся CEC к неповрежденной мембране Descemet. Поместите роговицу в сварную посуду и пипетку 30 микролитров трипан-синего на эндотелиальный слой на 30 секунд. Используйте щипцы, чтобы мягко раскачивать роговицу, чтобы убедиться, что вся эндотелиальная поверхность покрыта.
Смойте избыток трипан-синего в PDS кальцием и магнием и визуализируйте окрашенную роговицу под рассекающим микроскопом в течение нулевой точки времени. После завершения этой процедуры культивируют роговицу в шестилуночной пластине, содержащей низкую сывороточную среду, состоящую из следующих перечисленных компонентов. Культивируйте левую роговицу в восьми мельницах только из низкой сывороточной среды, а правую роговицу в среде с низким содержанием сыворотки дополняют инженерным FGF-1 или другими желаемыми тестовыми процедурами.
Инкубируйте роговицу при 37 градусах Цельсия с 6% CO2 в течение 14 дней с ежедневными изменениями среды. Повторяйте процедуру окрашивания трипана в течение трех, шести, девяти, 12 и 14 дней и визуализируйте каждую роговицу сразу после окрашивания. Убедитесь, что настройки камеры согласованы во всех временных точках.
После периода культивирования дополнительные пятна могут быть выполнены на роговице на основе исследовательских интересов, конкретных для эксперимента. Дополнительные пятна, имеющие отношение к исследовательским интересам нашей лаборатории, включают окрашивание ализарином, а также флуоресцентное окрашивание для включения EDU и белки плотного соединения ZO-1. Окрашивание ализарином выполняется для визуализации границ клеток для подтверждения результатов окрашивания трипана и визуализации морфологии клеток в заживленной области.
Иммунофлуоресцентное окрашивание ZO-1 позволяет визуализировать образование плотного соединения между CEC, что представляет особый интерес в заживленной области и вокруг нее. Маркировка EdU выполняется в качестве качественной меры для подтверждения того, что пролиферация способствует заживлению, а также может быть использована для количественной оценки пролиферирующих клеток в некоторых контекстах. Более подробная инструкция о том, как выполнять эти специфические процедуры окрашивания, включена в статью, соответствующую этому видео.
Вот репрезентативные изображения пары роговиц, признанных дистрофическими Eye-Bank, которые были инкубированы с или без инженерного FGF-1 в течение 14 дней. Как видно на изображениях, разработанная FGF-1, обработанная роговицей, продемонстрировала ускоренное заживление по сравнению с необработанной контрольной роговицей. Дополнительное окрашивание ализарином в конце периода культивирования послужило для очерчивания клеточных границ и подтверждено этими находками.
Это наблюдение было воспроизведено на 11 парах дистрофических роговиц, чтобы подтвердить модель в образце роговицы, наиболее подходящей для клинической процедуры DSO. Программное обеспечение для обработки изображений, такое как ImageJ, может использоваться для измерения окрашенной области на этих изображениях для количественной оценки прогресса заживления ран, как можно увидеть здесь. Все дистрофические роговицы, обработанные инженерным FGF-1, показали большее заживление на 14-й день по сравнению с необработанным матом, что привело в среднем к заживлению 91%, в отличие от 38% в контрольных роговицах.
И эта разница была статистически значимой. Дополнительная иммуногистохимия, визуализированная конфокальной визуализацией, выявила полуорганизованную экспрессию белка плотного соединения ZO-1, отражая предыдущие паттерны окрашивания ализарином. Маркировка EDU подтвердила наличие пролиферирующих клеток в области раны и вокруг нее и была видна в более высоких уровнях в обработанных роговицах по сравнению с необработанными контрольными группами.
В некоторых парах роговицы смерть CEC может быть видна периферически к области раны, особенно в дистрофических роговицах. Вот примеры изображений окрашенных трипаном роговиц, демонстрирующих значительную гибель периферических клеток. Как видно на изображениях, гибель периферических клеток происходит в основном в более ранние моменты времени и постепенно меняется вспять в течение периода культивирования.
Это периферическое окрашивание может затруднить количественное определение области раны, когда она соединяется с раной, поскольку может быть трудно определить местоположение края раневой области. Однако во всех случаях периферическое окрашивание трипана очищается достаточно, чтобы получить измеримые изображения в последний день 14 времени. Мы считаем, что это явление уникально для донорской роговицы, культивируемой ex vivo, и не имеет отношения к роговице человека in vivo.
Поскольку о повреждении периферического эндотелия не сообщалось ни в одном клиническом тематическом исследовании ДСО, насколько нам известно. Второй рисунок окрашивания, называемый дальним периферийным окрашиванием, был запечатлен на красных изображениях Ализарина, но также был очевиден на трипановых синих изображениях на протяжении всего периода культуры. Это наблюдение характеризуется кольцом темного окрашивания вокруг лимбуса, что указывает на скомпрометированный эндотелий.
Несмотря на этот термин, эта картина была настолько распространена как в нормальных, так и в дистрофических роговицах, что они не считались положительными для периферического окрашивания. Этот протокол позволил нам продемонстрировать улучшенные результаты заживления в культивируемых роговицах, обработанных инженерным FGF-1 после удаления Descemet. Кроме того, этот протокол зачистки служит ценным методом для других исследователей, изучающих DSO, и может быть использован для широкого спектра применений, включая тестирование других методов заживления ран, оценку модификаций хирургической техники и сравнение заживления в разных донорских популяциях или стадиях заболевания.
Мы надеемся, что это исследование и другие исследования с использованием этого протокола побуждают клиницистов рассматривать DSO в качестве ценного варианта лечения для своих пациентов с FECD в будущем.
