Этот протокол может быть полезен для решения вопросов о роли сосудистых сплетений и периферических иммунных клеток в регуляции мозга в различных контекстах в мышиных моделях. Этот протокол позволяет проводить углубленный количественный и качественный анализ уникальных популяций иммунных клеток в сосудисто-мозговых сплетениях мышей. Рассечение сосудистого сплетения может быть затруднено в начале из-за их небольшого размера и прозрачного цвета.
Мы рекомендуем сначала практиковаться на неперфузированных животных. Для начала расположите мозг, рассеченный от черной спинной стороны шести мышей C57, вверх в чашке Петри и поместите чашку ниже целей бинокулярных петель. Поддерживая мозг на месте с помощью щипцов, вставьте два конца другой пары щипцов вниз через среднюю линию между полушариями.
С помощью щипцов оттягивайте кору с мозолью и гиппокампом подальше от перегородки, обнажая боковой желудочек и часть третьего желудочка. Определите боковое сосудистое сплетение как длинную вуаль, выстилающую боковой желудочек и вспыхивающую на обоих концах. Затем, используя два конца тонких щипцов, соберите боковое сосудистое сплетение.
Будьте осторожны, чтобы собрать треугольную заднюю часть, скрытую задней складкой гиппокампа. Затем оттяните кору с мозолистым телом и гиппокампом контралатерального полушария подальше от перегородки, чтобы обнажить весь третий желудочек и противоположный боковой желудочек. Используя тонкие щипцы, соберите третье сосудистое сплетение, идентифицированное как короткая структура с зернистым аспектом поверхности.
Затем соберите другое боковое сосудистое сплетение. Затем вставьте два конца щипцов вниз между мозжечком и средним мозгом и отделите мозжечок от понса и продолговатого мозга, чтобы обнажить четвертый желудочек. Затем определите четвертое сосудистое сплетение как длинную шаровидную структуру с зернистым аспектом поверхности, который выстилает четвертый желудочек от бокового правого конца к левому концу между мозжечком и мозгом.
Используя тонкие щипцы, соберите четвертое сосудистое сплетение. После инкубации всех собранных сосудисто-сосудистых сплетений с коллагеназой IV осторожно пипеткой вверх и вниз около 10 раз, чтобы завершить диссоциацию. Затем заполните трубку до 1,5 миллилитров буфером MACS, чтобы остановить активность коллагеназы IV.
Затем центрифугируют клетки и отбрасывают супернатант перед промывкой клеток 1,5 миллилитрами буфера MACS. После добавления соответствующих компенсационных шариков и растворов антител инкубируют образцы на льду в течение 30-45 минут, защищая их от воздействия света. Затем заполните трубки 1,5 миллилитрами буфера MACS и центрифугируйте ячейки и компенсационные шарики.
После повторного использования ячеек и компенсационных шариков в 500 микролитрах буфера MACS отфильтруйте клетки через 70-микронный ситечко. После включения проточного цитометра и программного обеспечения выберите область прямого рассеяния по сравнению с областью бокового рассеяния и затвором для ячеек в зависимости от размера. Затем создайте дочерний затвор для одиночных ячеек с прямой площадью рассеяния по сравнению с высотой прямого рассеяния.
Затем создайте дочерний затвор для живых ячеек с областью DAPI и прямого рассеяния, чтобы исключить положительные ячейки DAPI. Затем создайте дочерний затвор для CD45-положительных иммунных клеток с CD45 по сравнению с областью прямого рассеяния. Теперь создайте дочерний затвор из CD45-положительных клеток и выберите F480 против CD11b, чтобы идентифицировать CD11b положительные F480 положительные и CD11b положительные F480 отрицательные популяции.
Затем создайте дочерний затвор для CD11b-положительных F480-положительных клеток и выберите CX3CR1 против IA-IE для идентификации как CX3CR1-положительных IA-IE положительных пограничных макрофагов, так и CX3CR1 положительных IA-IE отрицательных макрофагов. Затем создайте дочерний затвор для CD11b-положительных F480 положительных CX3CR1 положительных IA-IE отрицательных макрофагов и выберите F480 против CD11b, чтобы идентифицировать как CD11b высокий F480 промежуточный CX3CR1 положительный CX3CR1 положительный IA-IE отрицательный макрофаги колмера эпиплексуса, так и CD11b положительный F480 высокий CX3CR1 положительный IA-IE отрицательные границо-ассоциированные макрофаги. Затем из CD11b положительной отрицательной популяции F480, ворота для Ly6C против IA-IE.
Выберите как IA-IE положительную Ly6C-отрицательную популяцию, так и IA-IE отрицательные Ly6C-положительные клетки, которые в основном соответствуют моноцитам или нейтрофилам. Наконец, создайте дочерний затвор для CD11b положительной F480 отрицательной IA-IE положительной Ly6C отрицательной популяции и выберите CD11b против CX3CR1. Затем определите как CD11b высокий CX3CR1 низкий, так и CD11b положительный CX3CR1 отрицательные популяции.
Для Т-клеточного гатинга, после исключения DAPI-положительных клеток, как описано ранее, создайте дочерний затвор для CD45-положительных иммунных клеток с CD45 по сравнению с FSC-A, затем создайте дочерний затвор из CD45-положительных клеток и выберите TCR beta против CD11b. Исключите CD11b положительные миелоидные клетки и выберите TCR-положительную CD11b-отрицательную популяцию Т-клеток. Наконец, создайте дочерний затвор для бета-положительной популяции TCR CD11b и выберите CD4 против CD8a.
Идентифицировать как CD8 отрицательные, так и CD4 положительные Т-клетки и CD8 положительные CD4 отрицательные Т-клетки. Анализ проточной цитометрии, продемонстрированный здесь, успешно выявил основные подмножества миелоидных и Т-клеток и их относительное общее количество на мышь высоко воспроизводимым способом. Анализ проточной цитометрии миелоидных клеток показывает, что сосудистое сплетение населено CD11b-положительными CX3CR1-положительными F480 высокограйдер-ассоциированными макрофагами, представляющими 80% CD45-положительных иммунных клеток в сосудистом сплетении.
Также была идентифицирована CD11b high F480 intermediate CX3CR1 положительная IA-IE отрицательная популяция макрофагов эпиплексуса Колмера. Среди CD11b-положительных F480-отрицательных иммунных клеток были охарактеризованы две различные популяции Ly6C-отрицательных IA-IE-положительных клеток, которые, вероятно, соответствуют дендритным клеткам. Анализ и стратегия измерения Т-клеток выявили наличие незначительной популяции CD45 положительных CD11b отрицательных TCR бета-положительных клеток.
Среди них около 30-50 CD8 отрицательных CD4 положительных и CD8 положительных CD4 отрицательных Т-клеток на мышь заселяли сосудистое сплетение в физиологических условиях. Важно контролировать качество перфузии, так как любое загрязнение крови может размыть иммунный состав сосудистого сплетения. Этот метод может сопровождаться сортировкой выбранных клеточных популяций для дальнейшего анализа, такого как объемное или одноклеточное секвенирование РНК.
