قد يكون هذا البروتوكول مفيدا لمعالجة الأسئلة حول دور الضفائر المشيمية والخلايا المناعية الطرفية في تنظيم الدماغ في سياقات مختلفة في نماذج الفئران. يسمح هذا البروتوكول بإجراء تحليل كمي ونوعي متعمق لمجموعات الخلايا المناعية الفريدة في الضفائر المشيمية للفئران. يمكن أن يكون تشريح الضفائر المشيمية صعبا في البداية بسبب صغر حجمها ولونها الشفاف.
نوصي بالتدرب على الحيوانات غير المنصهرة أولا. للبدء ، ضع الدماغ التشريح من الجانب الظهري الأسود C57 المكون من ستة فئران في طبق بتري ووضع الطبق أسفل أهداف الحلقات ثنائية العين. مع الحفاظ على الدماغ في مكانه باستخدام الملقط ، أدخل طرفي زوج آخر من الملقط لأسفل من خلال خط الوسط بين نصفي الكرة الأرضية.
باستخدام الملقط ، اسحب القشرة مع الثفني والحصين بعيدا عن الحاجز ، مما يعرض البطين الجانبي وجزء من البطين الثالث. حدد الضفيرة المشيمية الجانبية كحجاب طويل يبطن البطين الجانبي ويشتعل في كلا الطرفين. ثم باستخدام طرفين من ملقط رقيق ، قم بجمع الضفيرة المشيمية الجانبية.
كن حريصا على جمع الجزء الخلفي المثلث المخفي بواسطة الطية الخلفية للحصين. بعد ذلك ، اسحب القشرة مع الجسم الثفني والحصين في نصف الكرة المقابل بعيدا عن الحاجز لفضح البطين الثالث بأكمله والبطين الجانبي المقابل. باستخدام ملقط ناعم ، اجمع الضفيرة المشيمية الثالثة التي تم تحديدها على أنها بنية قصيرة ذات جانب سطحي حبيبي.
ثم جمع الضفيرة المشيمية الجانبية الأخرى. بعد ذلك ، أدخل طرفي الملقط لأسفل بين المخيخ والدماغ المتوسط وافصل المخيخ عن البونس والنخاع لفضح البطين الرابع. ثم حدد الضفيرة المشيمية الرابعة كبنية كروية طويلة ذات جانب سطحي حبيبي يبطن البطين الرابع من الطرف الأيمن الجانبي إلى الطرف الأيسر بين المخيخ والنخاع.
باستخدام ملقط ناعم ، اجمع الضفيرة المشيمية الرابعة. بعد احتضان جميع الضفائر المشيمية التي تم جمعها باستخدام الكولاجيناز الرابع ، قم بماصة بلطف لأعلى ولأسفل حوالي 10 مرات لإنهاء الانفصال. ثم املأ الأنبوب إلى 1.5 ملليلتر بمخزن MACS المؤقت لوقف نشاط الكولاجيناز IV.
بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا وتخلص من supernatant قبل غسل الخلايا ب 1.5 ملليلتر من المخزن المؤقت MACS. بعد إضافة حبات التعويض المناسبة ومحاليل الأجسام المضادة ، احتضن العينات على الثلج لمدة 30 إلى 45 دقيقة ، وحمايتها من التعرض للضوء. ثم املأ الأنابيب ب 1.5 ملليلتر من المخزن المؤقت MACS وقم بالطرد المركزي للخلايا وخرز التعويض.
بعد تعليق الخلايا وخرز التعويض في 500 ميكرولتر من مخزن MACS المؤقت ، قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة 70 ميكرون. بعد تشغيل مقياس التدفق الخلوي والبرنامج، حدد منطقة التشتت الأمامي مقابل منطقة التشتت الجانبية وبوابة للخلايا بناء على الحجم. ثم قم بإنشاء بوابة ابنة للخلايا المفردة ذات منطقة التشتت الأمامية مقابل ارتفاع التشتت الأمامي.
بعد ذلك ، قم بإنشاء بوابة فرعية للخلايا الحية مع منطقة تشتت DAPI مقابل منطقة تشتت أمامية لاستبعاد الخلايا الإيجابية DAPI. ثم قم بإنشاء بوابة ابنة للخلايا المناعية الإيجابية CD45 مع CD45 مقابل منطقة التشتت الأمامية. الآن ، قم بإنشاء بوابة ابنة من الخلايا الإيجابية CD45 وحدد F480 مقابل CD11b لتحديد CD11b الإيجابي F480 الإيجابي و CD11b الإيجابي F480 المجموعات السلبية.
ثم قم بإنشاء بوابة فرعية للخلايا الموجبة F480 الموجبة CD11b وحدد CX3CR1 مقابل IA-IE لتحديد كل من البلاعم الإيجابية المرتبطة بالحدود الإيجابية ل CX3CR1 و CX3CR1 البلاعم السالبة IA-IE الإيجابية. بعد ذلك ، قم بإنشاء بوابة ابنة للبلاعم السالبة الموجبة ل CD11b F480 CX3CR1 الإيجابية IA-IE وحدد F480 مقابل CD11b لتحديد كل من البلاعم السالبة ذات الشكل الوسيط Cx3CR1 الوسيط الوسيط ل IA-IE الموجب ل Kolmer و CD11b الإيجابي F480 عالي CX3CR1 إيجابي IA-IE البلاعم ذات الحدود السالبة. ثم من CD11b إيجابية F480 السكان السلبية، بوابة ل Ly6C مقابل IA-IE.
حدد كلا من السكان السالبين ل IA-IE Ly6C الإيجابيين والخلايا الإيجابية Ly6C السلبية ل IA-IE التي تتوافق بشكل أساسي مع الخلايا الوحيدة أو العدلات. أخيرا ، قم بإنشاء بوابة فرعية ل CD11b إيجابية F480 IA-IE إيجابية Ly6C سلبية السكان وحدد CD11b مقابل CX3CR1. ثم حدد كلا من CD11b عالية CX3CR1 منخفضة و CD11b إيجابية CX3CR1 السكان السلبية.
بالنسبة لبوابة الخلايا التائية ، بعد استبعاد الخلايا الإيجابية DAPI كما هو موضح سابقا ، قم بإنشاء بوابة ابنة للخلايا المناعية الإيجابية CD45 مع CD45 مقابل FSC-A ، ثم قم بإنشاء بوابة ابنة من الخلايا الإيجابية CD45 وحدد TCR beta مقابل CD11b. استبعد الخلايا النخاعية الإيجابية CD11b وحدد مجموعة الخلايا التائية الإيجابية CD11b الإيجابية TCR. أخيرا ، قم بإنشاء بوابة فرعية لمجتمع CD11b الإيجابي ل TCR beta وحدد CD4 مقابل CD8a.
حدد كل من الخلايا التائية السلبية CD8 و CD4 الإيجابية و CD8 إيجابية CD4 الخلايا التائية السلبية. كشفت تحليلات قياس التدفق الخلوي الموضحة هنا بنجاح عن مجموعات فرعية رئيسية من الخلايا النخاعية والخلايا التائية وعددها الإجمالي النسبي لكل فأر بطريقة قابلة للتكرار بشكل كبير. يظهر تحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا النخاعية أن الضفيرة المشيمية مملوءة بالبلاعم الموجبة CD11b CX3CR1 الإيجابية F480 عالية الحدود المرتبطة ، والتي تمثل 80٪ من الخلايا المناعية الإيجابية CD45 في الضفيرة المشيمية.
كما تم تحديد مجموعة CD11b الوسيطة العالية F480 CX3CR1 الإيجابية IA-IE السلبية للبلاعم الفوقية في كولمر. من بين الخلايا المناعية السلبية الإيجابية F480 CD11b ، تم تمييز مجموعتين مختلفتين من الخلايا الإيجابية Ly6C السلبية IA-IE ومن المحتمل أن تتوافق مع الخلايا المتغصنة. سلط تحليل واستراتيجية بوابات الخلايا التائية الضوء على وجود عدد قليل من الخلايا الإيجابية الإيجابية CD45 CD11b CD11b TCR الإيجابية.
من بينها ، حوالي 30-50 CD8 CD4 سلبي إيجابي و CD8 إيجابي CD4 خلايا T سلبية لكل فأر ملأ الضفيرة المشيمية في ظل ظروف فسيولوجية. من المهم التحكم في جودة التروية لأن أي تلوث للدم قد يطمس التركيب المناعي للضفيرة المشيمية. يمكن اتباع هذه الطريقة عن طريق فرز مجموعات الخلايا المختارة لمزيد من التحليل مثل تسلسل الحمض النووي الريبي السائب أو أحادي الخلية.
