이 프로토콜은 마우스 모델에서 다양한 맥락에서 뇌의 조절에서 맥락막 신경총과 말초 면역 세포의 역할에 관한 질문을 해결하는데 유용할 수 있다. 이 프로토콜은 마우스의 맥락막 신경총에서 독특한 면역 세포 집단에 대한 심층적 인 정량적 및 질적 분석을 가능하게합니다. 맥락막 신경총의 해부는 작은 크기와 투명한 색상으로 인해 처음에는 어려울 수 있습니다.
먼저 관류되지 않은 동물에 대해 연습하는 것이 좋습니다. 시작하려면 C57 검은 여섯 마리의 마우스 등쪽에서 해부 된 뇌를 페트리 접시에 올려 놓고 접시를 쌍안 루프의 목표 아래에 놓습니다. 포셉을 사용하여 뇌를 제자리에 유지하면서 반구 사이의 중간 선을 통해 다른 한 쌍의 포셉의 두 끝을 삽입하십시오.
포셉을 사용하여 캘로섬과 해마가있는 피질을 중격에서 당겨 측심실과 세 번째 심실의 일부를 노출시킵니다. 측면 맥락막 신경총을 측면 심실을 감싸고 양쪽 끝에서 불타는 긴 베일로 확인하십시오. 그런 다음 얇은 집게의 두 끝을 사용하여 측면 맥락막 신경총을 수집하십시오.
해마의 후부 주름에 의해 숨겨진 삼각형 후부 부분을 수집하도록주의하십시오. 다음으로, 대측 반구의 코퍼스 캘로섬과 해마가있는 피질을 중격에서 멀리 당겨 세 번째 심실 전체와 반대쪽 측심실을 노출시킵니다. 미세한 포셉을 사용하여 세분화 된 표면 측면을 가진 짧은 구조로 확인 된 세 번째 맥락막 신경총을 수집하십시오.
그런 다음 다른 측면 맥락막 신경총을 수집하십시오. 다음으로, 소뇌와 중뇌 사이에 포셉의 두 끝을 삽입하고 소뇌와 수질에서 소뇌를 분리하여 네 번째 심실을 노출시킵니다. 그런 다음 네 번째 맥락막 신경총을 측면 오른쪽 끝에서 소뇌와 수질 사이의 왼쪽 끝으로 네 번째 심실을 정렬하는 세분화 된 표면 측면이있는 긴 구상 구조로 확인하십시오.
미세한 포셉을 사용하여 네 번째 맥락막 신경총을 수집하십시오. 수집된 모든 맥락막 신경총을 콜라게나제 IV로 인큐베이션한 후, 약 10회 정도 위아래로 부드럽게 피펫을 올려 해리를 마무리한다. 그런 다음 튜브를 MACS 버퍼로 1.5 밀리리터로 채워 콜라게나제 IV 활성을 정지시킨다.
다음으로, 세포를 원심분리하고, 세포를 1.5 밀리리터의 MACS 완충액으로 세척하기 전에 상층액을 버린다. 적절한 보상 비드 및 항체 용액을 첨가한 후, 샘플을 30 내지 45분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하여, 광 노출로부터 보호한다. 그런 다음 튜브를 1.5 밀리리터의 MACS 버퍼로 채우고 세포 및 보상 비드를 원심분리합니다.
세포 및 보상 비드를 500 마이크로리터의 MACS 완충액에 재현탁시킨 후, 세포를 70 미크론 스트레이너를 통해 여과한다. 유세포 분석기와 소프트웨어를 켠 후 크기에 따라 세포의 전방 산란 영역 대 측면 산란 영역 및 게이트를 선택합니다. 그런 다음 전방 산란 면적 대 전방 산란 높이가있는 단일 셀에 대한 딸 게이트를 만듭니다.
다음으로, DAPI 양성 세포를 제외하기 위해 DAPI 대 순방향 산란 영역을 갖는 살아있는 세포에 대한 딸 게이트를 만듭니다. 그런 다음 CD45 대 전방 산란 영역을 가진 CD45 양성 면역 세포에 대한 딸 게이트를 만듭니다. 이제 CD45 양성 세포로부터 딸 게이트를 만들고 F480 대 CD11b를 선택하여 CD11b 양성 F480 양성 및 CD11b 양성 F480 음성 집단을 확인합니다.
그런 다음 CD11b 양성 F480 양성 세포에 대한 딸 게이트를 만들고 CX3CR1 대 IA-IE를 선택하여 CX3CR1 양성 IA-IE 양성 경계 관련 대식세포와 CX3CR1 양성 IA-IE 음성 대식세포를 모두 확인합니다. 다음으로, CD11b 양성 F480 양성 CX3CR1 양성 IA-IE 음성 대식세포에 대한 딸 게이트를 만들고, F480 대 CD11b를 선택하여 CD11b 높은 F480 중간체 CX3CR1 양성 IA-IE 음성 콜머의 에피플렉서스 대식세포 및 CD11b 양성 F480 고 CX3CR1 양성 IA-IE 음성 경계 관련 대식세포 둘 다를 확인한다. 그런 다음 CD11b 양성 F480 음성 집단으로부터, Ly6C 대 IA-IE에 대한 게이트.
IA-IE 양성 Ly6C 음성 집단과 주로 단핵구 또는 호중구에 해당하는 IA-IE 음성 Ly6C 양성 세포를 모두 선택하십시오. 마지막으로, CD11b 양성 F480 음성 IA-IE 양성 Ly6C 음성 집단에 대한 딸 게이트를 만들고 CD11b 대 CX3CR1을 선택합니다. 그런 다음 CD11b 높은 CX3CR1 저와 CD11b 양성 CX3CR1 음성 집단 모두를 확인한다.
T 세포 게이팅의 경우, 앞서 설명한 바와 같이 DAPI 양성 세포를 배제한 후, CD45 대 FSC-A를 갖는 CD45 양성 면역 세포에 대한 딸 게이트를 생성한 다음, CD45 양성 세포로부터 딸 게이트를 생성하고 TCR 베타 대 CD11b를 선택한다. CD11b 양성 골수성 세포를 배제하고 TCR 양성 CD11b 음성 T 세포 집단을 선택한다. 마지막으로, TCR 베타 양성 CD11b 음성 집단에 대한 딸 게이트를 만들고 CD4 대 CD8a를 선택하십시오.
CD8 음성 및 CD4 양성 T 세포 및 CD8 양성 CD4 음성 T 세포 둘 다를 확인한다. 여기에서 입증 된 유세포 분석 결과는 골수성 및 T 세포의 주요 하위 집합과 마우스 당 상대적 총 수를 매우 재현 가능한 방식으로 성공적으로 밝혀 냈습니다. 골수성 세포의 유세포 분석 결과, 맥락막 신경총은 CD11b 양성 CX3CR1 양성 F480 고경계 관련 대식세포에 의해 채워지며, 맥락막 신경총에서 CD45 양성 면역 세포의 80%를 나타낸다는 것을 보여준다.
콜머 상피 대식세포의 CD11b 높은 F480 중간체 CX3CR1 양성 IA-IE 음성 집단이 또한 확인되었다. CD11b 양성 F480 음성 면역 세포 중에서, Ly6C 음성 IA-IE 양성 세포의 두 개의 상이한 집단이 수지상 세포에 상응할 가능성이 있는 특징이 있었다. T-세포의 분석 및 게이팅 전략은 CD45 양성 CD11b 음성 TCR 베타 양성 세포의 소수 집단의 존재를 강조했다.
그 중에서도, 마우스 당 약 30-50개의 CD8 음성 CD4 양성 및 CD8 양성 CD4 음성 T 세포는 생리학적 조건 하에서 맥락막 신경총을 채웠다. 모든 혈액 오염이 맥락막 신경총의 면역 성분을 흐리게 할 수 있기 때문에 관류의 품질을 조절하는 것이 중요합니다. 이 방법은 벌크 또는 단일 세포 RNA 시퀀싱과 같은 추가 분석을 위해 선택된 세포 집단의 분류에 뒤따를 수 있다.
