Este protocolo pode ser útil para abordar questões sobre o papel dos plexos coroides e células imunes periféricas na regulação do cérebro em vários contextos em modelos de camundongos. Este protocolo permite uma análise quantitativa e qualitativa aprofundada das populações únicas de células imunes nos plexos coroides dos camundongos. A dissecção dos plexos coroides pode ser difícil no início devido ao seu pequeno tamanho e cor transparente.
Recomendamos praticar em animais não perfumados primeiro. Para começar, posicione o cérebro dissecado de um c57 preto seis lado dorsal do rato para cima em uma placa de Petri e coloque a placa abaixo dos objetivos dos laços binóculos. Mantendo o cérebro no lugar usando fórceps, insira as duas extremidades de outro par de fórceps através da linha média entre os hemisférios.
Usando os fórceps, puxe o córtex com o caloso e o hipocampo para longe do septo, expondo o ventrículo lateral e uma parte do terceiro ventrículo. Identifique o plexo coroide lateral como um longo véu que reveste o ventrículo lateral e queimando em ambas as extremidades. Em seguida, usando duas extremidades de fórceps finos, colete o plexo coroide lateral.
Tenha cuidado para coletar a parte posterior triangular escondida pela dobra posterior do hipocampo. Em seguida, puxe o córtex com o corpus caloso e hipocampo do hemisfério contralateral para longe do septo para expor todo o terceiro ventrículo e o ventrículo lateral oposto. Utilizando fórceps finos, colete o terceiro plexo coroide identificado como uma estrutura curta com aspecto de superfície granular.
Em seguida, colete o outro plexo coroide lateral. Em seguida, insira as duas extremidades dos fórceps para baixo entre o cerebelo e o cérebro médio e retire o cerebelo dos pons e medulla para expor o quarto ventrículo. Em seguida, identifique o quarto plexo coroide como uma longa estrutura globular com um aspecto de superfície granular que reveste o quarto ventrículo da extremidade direita lateral para a extremidade esquerda entre o cerebelo e a medula.
Usando fórceps finos, colete o quarto plexo coroide. Depois de incubar todos os plexos coroides coletados com colagenase IV, gentilmente pipeta para cima e para baixo cerca de 10 vezes para finalizar a dissociação. Em seguida, encha o tubo a 1,5 mililitros com tampão MACS para parar a atividade de colagem iv.
Em seguida, centrifufique as células e descarte o supernaente antes de lavar as células com 1,5 mililitros de tampão MACS. Depois de adicionar as contas de compensação adequadas e soluções de anticorpos, incubar as amostras no gelo por 30 a 45 minutos, protegendo-as da exposição à luz. Em seguida, encha os tubos com 1,5 mililitros de tampão MACS e centrifugar as células e as contas de compensação.
Depois de reutilizar as células e as contas de compensação em 500 microliters de buffer MACS, filtrar as células através de um filtro de 70 mícrons. Depois de ligar o cítmetro de fluxo e o software, selecione área de dispersão dianteira versus área de dispersão lateral e portão para células com base no tamanho. Em seguida, crie um portão de filha para células únicas com área de dispersão dianteira versus altura de dispersão para a frente.
Em seguida, crie um portão de filha para células vivas com área de dispersão DAPI versus forward para excluir as células positivas da DAPI. Em seguida, crie um portão de filha para células imunes positivas CD45 com CD45 versus área de dispersão para a frente. Agora, crie um portão de filha a partir das células positivas CD45 e selecione F480 versus CD11b para identificar o CD11b positivo F480 positivo e o CD11b populações negativas F480.
Em seguida, crie um portão de filha para células positivas F480 positivas do CD11b e selecione CX3CR1 versus IA-IE para identificar tanto macrófagos positivos do CX3CR1 IA-IE positivos associados à fronteira quanto macrófagos negativos CX3CR1 positivos IA-IE. Em seguida, crie um portão de filha para CD11b positivo F480 positivo CX3CR1 positivo IA-IE macrófagos negativos e selecione F480 versus CD11b para identificar tanto o CD11b alto F480 intermediário CX3CR1 positivo IA-IE negativo Os macrófagos epiplexos de Kolmer e o CD11b positivo F480 alto CX3CR1 positivo IA-IE macrófagos negativos associados à fronteira. Em seguida, a partir do CD11b população negativa F480, portão para Ly6C versus IA-IE.
Selecione tanto a população negativa ly6C ly6C positiva do IA-IE quanto as células positivas ly6C negativas do IA-IE que correspondem principalmente a monócitos ou neutrófilos. Finalmente, crie um portão de filha para CD11b positivo F480 negativo IA-IE população negativa Ly6C e selecione CD11b versus CX3CR1. Em seguida, identifique tanto o CD11b high CX3CR1 baixo quanto o CD11b positivo CX3CR1 populações negativas.
Para gating de células T, depois de excluir as células positivas da DAPI como descrito anteriormente, crie um portão de filha para células imunes positivas CD45 com CD45 versus FSC-A, em seguida, crie um portão de filha a partir das células positivas CD45 e selecione TCR beta versus CD11b. Exclua as células mielóides positivas CD11b e selecione a população de células T negativas Tcr positivos TCR. Finalmente, crie um portão de filha para a população negativa TCR beta positivo CD11b e selecione CD4 versus CD8a.
Identifique tanto células T negativas cd8 quanto CD4 positivas e células T CD8 positivas. As análises de citometria de fluxo demonstradas aqui revelaram com sucesso os principais subconjuntos de mieloides e células T e seu número total relativo por rato de forma altamente reprodutível. A análise da citometria de fluxo das células mielóides mostra que o plexo coroóide é povoado por macrófagos f480 positivos do CD11b CX3CR1, associados à alta fronteira, representando 80% das células imunes positivas cd45 no plexo coroóide.
Também foi identificada a população negativa CX3CR1 média CX3CR1 do macrofago epiplexo de Kolmer. Entre as células imunes negativas F480 positivas do CD11b, duas populações diferentes de células positivas ly6C negativas ia-IE foram caracterizadas e provavelmente correspondem a células dendríticas. A estratégia de análise e gating das células T destacou a presença da população menor de células beta positivas do CD11b TCR negativo TCR.
Entre eles, cerca de 30-50 CD8 cd4 negativo CD4 positivo e CD8 positivo CD4 células T negativas por rato povoaram o plexo coroide sob condições fisiológicas. É importante controlar a qualidade da perfusão, uma vez que qualquer contaminação sanguínea pode borrar a composição imune do plexo coroide. Este método pode ser seguido pela classificação de populações celulares selecionadas para análises posteriores, como sequenciamento de RNA em massa ou unicelular.
