Эти методы могут помочь исследовать прогрессирование хронического воспаления, связанного с почками, у пациентов с волчанкой. Мы предлагаем надежную и экономически эффективную альтернативу, которая может быть использована для мониторинга течения заболевания при волчанке. Начните стерилизацию капюшона, распыляя 70% этанола и поместите стерильный пластиковый лист на поверхность.
Затем подготовьте наконечники, 1,5 миллилитровые трубки и пипетку, чтобы собрать около 20 микролитров мочи. Возьмите клетку и распылите 70% этанола, прежде чем поместить его в капот. После этого держите мышь одной рукой, а другой рукой мягко массируйте вентральную область сверху донизу.
Используя 1,5-миллилитровый тюбик или пипетку, соберите мочу напрямую. Или если капли образца собирают его из пластикового листа. Затем поместите мышь обратно в клетку.
Разрезать рассеченные почки на размер зерна и переварить в пяти миллилитрах буфера пищеварения, содержащего коллагеназу и ДНКазу 1 в среде RPMI 1640, содержащей HEPES, в течение одного часа с непрерывным мягким встряхиванием при 37 градусах Цельсия. Добавьте 10 миллилитров ледяного холодного PBS, содержащего 10 миллимоляров ЭДТА, и инкубируйте в течение 10 минут на льду. Затем дважды вихрь суспензии.
Затем фильтруйте клеточную суспензию через 100-микрометровый ситечко и промывайте 10 миллилитрами HBSS полным. После этого центрифугируют в 350 раз G в течение 10 минут при комнатной температуре. Приготовьте 30, 37 и 70% изотонический раствор Перколла и добавьте слой 37%-ного раствора Перколла поверх 70%-ного раствора.
Повторно суспендировать клетки в пяти миллилитрах 30% запаса изотонического Перколла. Используя пипетку Пастера, медленно загружайте 37% пяти миллилитров сверху и 70% пяти миллилитров внизу, делая запас изотоническим градиентом Перколла. Затем центрифугу с номером девять вверх и вниз номером ноль в 1000 раз G в течение 30 минут при комнатной температуре.
После этого соберите лейкоциты от границы раздела от 37 до 70% и повторно приостановите их в пяти миллилитрах С10. Опять же, центрифуга в 350 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Впоследствии приостановить ячейку гранулы в трех миллилитрах факсимильного буфера и центрифуги при 350 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Затем выбросьте супернатант, оставив около 50 микролитров от общего объема. Добавьте 50 микролитров блока рецепторов FC на пробирку. После этого смешивают и насиживают на льду в темноте в течение 10 минут.
Затем добавьте два миллилитра факсимильного буфера для стирки. Затем центрифугируют в 350 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и отбрасывают супернатент, оставляя около 50 микролитров от общего объема. Затем добавьте 20 микролитров соответствующего флуоресцентного красителя и дайте ему постоять в течение 15-30 минут на льду.
Добавьте 50 микролитров смеси антител на пробирку, содержащую CD 138 бриллиантовой фиалки семь 11 и CD 45 Alexa Fluor 700 и инкубируйте на льду в темноте в течение 15-30 минут. После этого добавьте три миллилитра буфера факса. Центрифуга в 350 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Удалите супернатант вакуумом, оставив около 50 микролитров от общего объема. Позже повторно суспендировать ячейку гранулы в 200 микролитрах PBS. Для сбора образца встраивают половину почки в небольшой пластиковый криомольд с оптимальной температурой резания соединения.
Затем добавьте сухой лед в пенополистироловый ящик и аккуратно поместите криомольд поверх сухого льда. Далее снимите криомольд, заверните его в алюминиевую фольгу и храните при минус 80 градусах Цельсия до дальнейшего использования. Затем зафиксируйте сухие до четырех микрометровых участков холодным ацетоном на 10 минут.
После фиксации горок высушите на воздухе от 0,5 до одного часа и храните их при минус 20 градусах Цельсия в течение короткого времени или минус 80 градусов Цельсия в течение длительного времени. Чтобы окрасить образцы, зафиксируйте слайды в холодном ацетоне на пять-10 минут и дайте секциям прогреться до комнатной температуры. После этого, используя ручку для похлопывания, нарисуйте гидрофобный круг вокруг секции и дайте ему высохнуть.
Затем поместите слайды в TBS в банку Copeland на 20 минут и аккуратно встряхните, положив банку на шейкер. После этого вылейте TBS и наполните банку TBS 5%BSA и 0,1%TW 20. Затем высиживайте банку в течение 20 минут, осторожно встряхивая шейкер.
Затем выньте слайды и протрите нижнюю часть слайдов. Добавьте в секцию 100 микролитров конъюгированных антител C3, соответствующих C и IgG2 APE, и инкубируйте комнатную температуру в увлажненной камере в течение одного часа. Трижды вымойте секцию в PBS 5%BSA и 0,1%TW 20 в течение 10 минут на шейкере, а затем высушите горки.
Установите секцию с помощью антивядающего реагента, а затем с помощью крышки. Затем храните слайды при четырех градусах Цельсия до просмотра под микроскопом. Для анализа изображений с помощью программного обеспечения image J наметьте нужную область.
После этого установите стандартные параметры, нажав на анализ, затем установите измерения и измерьте площадь, чтобы получить результаты. Затем перенесите данные, полученные из окон измерения, в электронную таблицу. После этого нажмите «Анализ», чтобы измерить регион и снова перенести данные в предыдущую электронную таблицу.
Уровни белка в моче мышей MRL LPR были обнаружены с течением времени, когда их обрабатывали фосфатно-буферным физиологическим раствором в качестве контрольной группы и lactobacillus reuteri в качестве группы лечения. Группа мышей, получавших L.reuteri с более агрессивным прогрессированием протеинурии, чем контрольная группа. Факсимильный анализ проводили для изолированных лейкоцитов почек для анализа плазматических клеток.
Кроме того, мышей лечили ванкомицином или ванкомицином вместе с двухцепочечной ДНК Escherichia coli. Хотя ожидалось, что двухцепочечная ДНК Escherichia coli вызовет почечную инфильтрацию, не было обнаружено существенной разницы в процентном соотношении плазматических клеток. Комплемент C3 и IgG2a были обнаружены путем иммунофлуоресцентного окрашивания на женских участках почек MRL IPR.
Эффективные факторы окружающей среды на почечное осаждение C3 и IgG2a сравнивали для собственного мышиного хлеба на животноводческом объекте и тех, которые были приобретены у продавца. Иммуногистохимический анализ не показал никакой разницы между двумя группами. Добавление каждого слоя процентного запаса ISO 20 Percoll solution может быть сложной задачей, и если они смешиваются, вам придется начинать все сначала.
Эта процедура помогает с проточным цитометром и в экспериментах с виттером, поэтому вы не можете изучать различные типы популяций клеток почек. Эта процедура позволяет изучить инфильтраты В-клеток в почках и информации в литературе не так много.
