Diese Methoden können helfen, das Fortschreiten chronischer Nierenentzündungen bei Lupuspatienten zu untersuchen. Wir bieten eine zuverlässige und kostengünstige Alternative, mit der der Krankheitsverlauf bei Lupus überwacht werden kann. Beginnen Sie mit der Sterilisation der Haube, indem Sie 70% Ethanol sprühen und eine sterile Plastikfolie auf die Oberfläche legen.
Dann bereiten Sie Spitzen, 1,5-Milliliter-Röhrchen und eine Pipette vor, um etwa 20 Mikroliter des Urins zu sammeln. Nehmen Sie den Käfig und sprühen Sie 70% Ethanol, bevor Sie ihn in die Haube legen. Danach halten Sie die Maus mit einer Hand und massieren mit der anderen Hand sanft den ventralen Bereich von oben nach unten.
Sammeln Sie den Urin mit einem 1,5-Milliliter-Röhrchen oder einer Pipette direkt. Oder wenn die Probentropfen sie von der Plastikfolie sammeln. Setzen Sie dann die Maus wieder in den Käfig.
Die sezierten Nieren in Korngröße schneiden und in fünf Milliliter Verdauungspuffer mit Kollagenase und DNase 1 in RPMI 1640 Medium mit HEPES für eine Stunde unter kontinuierlichem sanftem Schütteln bei 37 Grad Celsius verdauen. Fügen Sie 10 Milliliter eiskaltes PBS mit 10 Millimol EDTA hinzu und inkubieren Sie für 10 Minuten auf Eis. Dann wirbeln Sie die Aufhängung zweimal durch.
Später filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 100-Mikrometer-Sieb und waschen Sie sie mit 10 Milliliter HBSS voll. Danach bei 350 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Bereiten Sie eine isotonische 30-, 37- und 70%ige Standard-Percoll-Lösung vor und fügen Sie eine Schicht 37%iger Percoll-Lösung auf die 70%ige Lösung auf.
Resuspendieren Sie die Zellen in fünf Milliliter von 30% Standard-isotonischem Percoll. Mit einer Pasteur-Pipette werden langsam 37% von fünf Milliliter oben und 70% von fünf Milliliter unten geladen, wodurch ein isotonischer Percoll-Gradient entsteht. Dann zentrifugieren Sie mit oben Nummer neun und unten Nummer Null bei 1000 mal G für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
Danach sammeln Sie Leukozyten von der 37 bis 70%-Schnittstelle und suspendieren sie in fünf Milliliter C10. Auch hier zentrifugieren Sie bei 350 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Anschließend wird das Zellpellet in drei Milliliter Faxpuffer resuspendiert und bei 350 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert.
Dann verwerfen Sie den Überstand, der etwa 50 Mikroliter des Gesamtvolumens übrig lässt. Fügen Sie 50 Mikroliter FC-Rezeptorblock pro Röhrchen hinzu. Danach mischen und 10 Minuten auf Eis im Dunkeln inkubieren.
Fügen Sie später zwei Milliliter Faxpuffer zum Waschen hinzu. Dann zentrifugieren Sie bei 350 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie den Überstand, so dass etwa 50 Mikroliter des Gesamtvolumens übrig bleiben. Als nächstes fügen Sie 20 Mikroliter des entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffs hinzu und lassen Sie ihn 15 bis 30 Minuten auf Eis stehen.
50 Mikroliter Antikörpermischung pro Röhrchen mit CD 138 brillantviolett sieben 11 und CD 45 Alexa Fluor 700 zugeben und 15 bis 30 Minuten auf Eis im Dunkeln inkubieren. Fügen Sie anschließend drei Milliliter Faxpuffer hinzu. Zentrifugieren bei 350 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Entfernen Sie den Überstand durch Vakuum, wobei etwa 50 Mikroliter des Gesamtvolumens übrig bleiben. Später suspendieren Sie das Zellpellet in 200 Mikroliter PBS. Um die Probe zu sammeln, betten Sie die halbe Niere in den kleinen Kunststoffkryomold mit der optimalen Schnitttemperaturverbindung ein.
Dann Trockeneis in eine Styroporschaumbox geben und das Kryomold vorsichtig auf das Trockeneis legen. Als nächstes entfernen Sie die Kryoform, wickeln Sie sie in Aluminiumfolie und lagern Sie sie bis zur weiteren Verwendung bei minus 80 Grad Celsius. Anschließend fixieren Sie die trockenen auf vier Mikrometer Abschnitte mit kaltem Aceton für 10 Minuten.
Nach dem Befestigen der Dias 0,5 bis eine Stunde an der Luft trocknen und kurzzeitig bei minus 20 Grad Celsius oder lange bei minus 80 Grad Celsius lagern. Um die Proben zu färben, fixieren Sie die Objektträger für fünf bis 10 Minuten in kaltem Aceton und lassen Sie die Abschnitte auf Raumtemperatur erwärmen. Zeichnen Sie anschließend mit einem Klapsstift einen hydrophoben Kreis um den Abschnitt und lassen Sie ihn trocknen.
Dann legen Sie die Dias in TBS für 20 Minuten in das Copeland-Glas und schütteln Sie vorsichtig, indem Sie das Glas auf den Shaker stellen. Anschließend TBS abgießen und das Glas mit TBS 5% BSA und 0,1% TW 20 füllen. Später inkubieren Sie das Glas für 20 Minuten, indem Sie leicht auf dem Shaker schütteln.
Nehmen Sie dann die Folien heraus und wischen Sie die Unterseite der Folien ab. Fügen Sie 100 Mikroliter konjugierte Antikörper C3 fit C und IgG2 APE in den Abschnitt und inkubieren Sie die Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer für eine Stunde. Waschen Sie den Abschnitt dreimal in PBS 5% BSA und 0,1% TW 20 für 10 Minuten auf dem Shaker und schütteln Sie dann die Objektträger trocken.
Montieren Sie den Abschnitt mit einem Anti-Fade-Reagenz und dann mit einem Abdeckglas. Dann lagern Sie die Objektträger bei vier Grad Celsius, bis sie unter dem Mikroskop betrachtet werden. Für die Bildanalyse mit der Image J-Software skizzieren Sie den gewünschten Bereich.
Danach legen Sie Standardparameter fest, indem Sie auf Analysieren klicken, dann Messungen und Messbereich festlegen, um die Ergebnisse zu erhalten. Als nächstes übertragen Sie die aus den Messfenstern erhaltenen Daten in eine Tabelle. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Analysieren, um die Region zu messen und die Daten erneut in die vorherige Tabelle zu übertragen.
Die Proteinspiegel im Urin von MRL LPR-Mäusen wurden im Laufe der Zeit nachgewiesen, wo sie mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung als Kontrollgruppe und Lactobacillus reuteri als Behandlungsgruppe behandelt wurden. Die Mäusegruppe behandelte mit L.reuteri eine aggressivere Proteinurie-Progression als die Kontrollgruppe. Die Faxanalyse wurde für die isolierten Nierenleukozyten durchgeführt, um die Plasmazellen zu analysieren.
Weiterhin wurden die Mäuse mit Vancomycin oder Vancomycin zusammen mit Escherichia coli doppelsträngiger DNA behandelt. Obwohl erwartet wurde, dass Escherichia coli doppelsträngige DNA die Niereninfiltration auslöst, wurde kein signifikanter Unterschied im Prozentsatz der Plasmazellen gefunden. Die Komplemente C3 und IgG2a wurden durch Immunfluoreszenzfärbung an weiblichen MRL-IPR-Nierenabschnitten nachgewiesen.
Die effektiven Umweltfaktoren auf die renale Ablagerung von C3 und IgG2a wurden für das hauseigene Mäusebrot in der Tierhaltung und das von einem Verkäufer gekaufte verglichen. Die immunhistochemische Analyse zeigte keinen Unterschied zwischen den beiden Gruppen. Das Hinzufügen jeder Schicht der prozentualen ISO 20 Percoll-Lösung kann eine Herausforderung sein, und wenn sie gemischt werden, müssen Sie von vorne beginnen.
Dieses Verfahren hilft beim Durchflusszytometer und in Vitter-Experimenten, so dass Sie die verschiedenen Nierenzelltypen von Populationen nicht untersuchen können. Dieses Verfahren ermöglicht es uns, die in den Nieren infiltrierten B-Zellen zu untersuchen, und es gibt nicht viele Informationen in der Literatur.
