Этот протокол предлагает метод доставки генной терапии к нескольким глазным тканям безопасным, простым и эффективным способом. Он также адаптируется для интрастромальных и субретинальных инъекций у мелких животных. Использование субконъюнктивального пути инъекции является минимально инвазивным.
Это создает меньше рисков и имеет большие перспективы для доставки AV для лечения нескольких глазных заболеваний. Поскольку более 1 миллиарда человек во всем мире страдают от нарушений зрения, использование безопасного и простого метода доставки лекарств обеспечивает широкое применение для лечения многих различных причин слепоты. Методы доставки генов, описанные в этом протоколе, представляют особый интерес для тех, кто разрабатывает потенциальные стратегии вмешательства и практикующих офтальмологов, которые в конечном итоге доставят эти препараты пациентам.
Самой большой проблемой для тех, кто выполняет этот протокол впервые, вероятно, является введение иглы в понятие конъюнктивального пространства. Для начала соберите систему впрыска, поместив стереомикроскоп и шприцевой насос в шкаф биобезопасности. Далее разрезаем полиэтиленовую трубку на длину примерно 50 сантиметров.
Вставьте конец иглы 36-го калибра в один конец трубки. Затем наполните одноразовый 3-миллилитровый шприц стерильной водой и вставьте его в сторону трубки напротив иглы. Промывайте трубку три раза, чередуя стерильную воду и 70% спирт, чтобы дезинфицировать трубку и убедиться, что нет утечек, засоров или повреждений по всей трубке.
Используя одноразовый 3-миллилитровый шприц, наполните трубку стерильной водой и оставьте трубку прикрепленной к одноразовому шприцу. Затем поместите кусок пенопласта на поверхность шкафа биобезопасности и добавьте в него бассейн со стерильной водой. Погрузите часть трубки, подключенную к игле, в бассейн со стерильной водой.
Затем вытащите одноразовый шприц из отверстия трубки, чтобы предотвратить попадание воздуха в систему трубок после извлечения шприца. Затем наполните 10-микролитровый шприц Гамильтона стерильной водой. Затем подключите иглу шприца Гамильтона к открытому концу трубки, погружая кончик иглы шприца Гамильтона в бассейн со стерильной водой на парапленке.
Нажмите и удерживайте быструю кнопку заднего хода на экране насоса, чтобы переместить толкающие блоки на приблизительную длину шприца. Затем открутите зажимные ручки кронштейна, чтобы ослабить стопорные кронштейны на толкателе и блоках держателя шприца. Затем загрузите шприц Hamilton на блок держателя шприца и закрепите шприц в соответствии с инструкциями производителя.
Чтобы настроить параметры на экране настроек насоса, нажмите кнопку «Усилие» и установите уровень силы на уровне 30%Затем примите изменения, чтобы вернуться на экран настроек. Нажмите кнопку «Быстрый запуск», выберите «Метод», а затем выберите параметр «Только вливать». Для варианта шприца выберите Hamilton 1700, затем нажмите «Стекло» и выберите 10 микролитров.
Затем выберите скорость инфузии и объем инъекции. Извлеките воду из шприца Гамильтона, оставив трубку и инъекционную иглу, наполненную водой, нажав кнопку Infuse". Затем выведите вирус, поместив инъекционную иглу в аликвоту запаса вируса.
Затем слегка потяните назад шприц Гамильтона, нажав кнопку обратного хода, чтобы ввести небольшой пузырь воздуха в трубку. После обезболивания животного захватите конъюнктиву щипцами. Затем вставьте иглу в конъюнктиву до тех пор, пока скос не будет полностью покрыт мембраной конъюнктивы, и положите иглу на глобус.
Одновременно запустите инъекцию, нажав кнопку Пуск с помощью ножного переключателя. Для изучения распределения вектора AAV глазные и окружающие ткани окрашивали гематоксилином и эозином. Репрезентативные сагиттальные срезы показали, что рассеивание индийских чернил происходило в основном рядом с экстраокулярными мышцами на внешней поверхности склеры в периокулярных рыхлых соединительных тканях.
Чтобы подтвердить трансдукцию самокомплектного AAV 8 через восемь недель после инъекции, обилие белка зеленой флуоресценции в поперечных сечениях исследовали иммунофлуоресцентным окрашиванием. Результаты показали, что векторы AAV 8 эффективно трансдуцировали периокулярные мышцы сзади от глаза и роговицы. Чтобы проанализировать векторное биораспределение, номера копий векторного генома и отдельные глазные компартменты в других органах, включая печень и сердце, были исследованы количественной полимеразной цепной реакцией с использованием праймеров и зондов, специфичных для трансгена.
Экспрессия трансгена была подтверждена количественной полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией, которая предполагала, что субконъюнктивальная инъекция AAV 8 приводит к экспрессии трансгена в веке, конъюнктиве, роговице и зрительном нерве. Воздушный пузырь будет служить барьером между водой в трубке и лечебным препаратом. Этот метод позволяет другим исследователям исследовать использование субконъюнктивального пути введения как для офтальмологических растворов, так и для глазной генной терапии для множественных заболеваний.
