CUT&RUN является мощным методом определения локализации белка на хроматине, и здесь мы описываем одноклеточную версию этой техники в ручном 96-луночном формате. Большинство методов локализации белка, таких как ChIP-seq, требуют высокой клеточной нагрузки и занимают примерно три дня. CUT&RUN, из-за высокого сигнала и низкого фона, был оптимизирован для применения с низкими и одноячечными ячейками и может быть завершен за один день.
Мы предполагаем, что этот метод может быть применен практически к любому биологическому образцу и может быть особенно мощным для определения локализации факторов в редких образцах с низким содержанием, таких как драгоценные образцы пациентов. Прежде чем проводить какие-либо одноклеточные эксперименты, протестируйте антитела и технику на большом количестве недрагоценных клеток. Основным ограничением этого эксперимента является зависимость от крепкого антитела.
Демонстрирует процедуру Сантана Лардо, опытный специалист-исследователь из моей лаборатории. После сортировки отдельных ячеек и связывания ядер с шариками поместите пластину из 96 лунок на магнитную стойку с 96 лунками и дайте шарикам связываться в течение как минимум пяти минут. Затем удалите и выбросьте супернатант.
Добавьте 100 микролитров блокирующего буфера к шарикам, связанным с ядром, смешайте с мягким пипетированием и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре. Поместите пластину на магнитную стойку с 96 лунками и дайте супернатанту очиститься в течение как минимум пяти минут. Затем удалите и выбросьте супернатант, не нарушая бусины.
Снимите пластину с магнитной стойки и повторно суспендируйте шарики в 100 микролитрах промывочного буфера за реакцию с мягким пипетированием. Поместите пластину обратно на магнитную стойку с 96 лунками, дайте супернатанту очиститься, а затем извлеките и выбросьте супернатант. Повторное суспендирование шариков в 25 микролитров промывочного буфера за реакцию с щадящим пипетированием.
Сделайте первичную смесь антител путем аликвотирования 25 микролитров промывочного буфера за реакцию, а затем добавьте 0,5 микролитра антитела за реакцию. Добавьте 25,5 микролитров буферной смеси антител с последующим мягким пипетированием к каждому образцу, обработанному антителом, нацеленным на интересующий белок. Инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре.
Затем снова поместите образцы обратно на магнитную стойку с 96 лунками. Как только супернатант очистится, удалите и выбросьте его, не беспокоя бусины. После снятия пластины с магнитной стойки вымойте бусины 100 микролитрами буфера для стирки и повторно суспендируйте пипеткой.
После размещения пластины обратно на магнитной стойке с 96 лунками и сброса супернатанта, как показано ранее, повторно суспендируйте каждый образец в 25 микролитрах буфера промывки. Сделайте мастер-смесь белковой А МНазы, добавив 25 микролитров промывочного буфера и оптимизированное количество белка А МНазы за реакцию. Добавьте 25 микролитров главной смеси белка А МНазы к каждому образцу, включая контрольные образцы.
Инкубируйте образцы в течение 30 минут при комнатной температуре. Поместите пластину на магнитную стойку с 96 лунками. Дайте супернатанту очиститься в течение как минимум пяти минут, а затем удалите и выбросьте супернатант, не нарушая бусины.
После снятия пластины с магнитной стойки вымойте бусины 100 микролитрами буфера для стирки и повторно суспендируйте мягким пипеткой. Поместите пластину на магнитную стойку с 96 лунками и выбросьте супернатант, как было показано ранее. Затем извлеките образцы из магнитной стойки и повторно суспендируйте бусины в 50 микролитрах буфера для стирки путем бережной пипетки.
Уравновесьте образцы до нуля градусов Цельсия в ледяной водной смеси в течение пяти минут, а затем извлеките образцы из ледяной водяной бани. Добавьте один микролитр 100-миллимолярного хлорида кальция с помощью многоканальной пипетки. Хорошо перемешайте три-пять раз с мягкой пипеткой с использованием многоканальной пипетки большого объема, а затем верните образцы к нулю градусов Цельсия.
Запустите 10-минутный таймер, как только тарелка вернется на ледяную водяную баню. Остановите реакцию путем пипетирования 50 микролитров раствора, содержащего вдвое большую концентрацию RSTOP+ и буфера, в каждую лунку в том же порядке, в котором добавляли хлорид кальция. Инкубируйте образцы в течение 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия.
Вращайте пластину в 16 000 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Поместите пластину на магнитную стойку с 96 лунками. Дайте супернатанту очиститься в течение как минимум пяти минут.
Затем переложите супернатанты на свежую 96-луночную тарелку и выбросьте бусины. Для экстракции ДНК добавьте один микролитр 10% SDS и 0,83 микролитра 20 миллиграммов на миллилитр протеиназы K к каждому образцу и перемешайте образцы путем бережного пипетирования. Инкубируйте образцы в течение 10 минут при температуре 70 градусов Цельсия.
Верните пластину к комнатной температуре. Добавьте 46,6 микролитров пятимолярного хлорида натрия и 90 микролитров 50% ПЭГ4000 и перемешайте путем бережного пипетирования. Добавьте 33 микролитра полистирольных магнетитовых шариков в каждый образец и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.
Поместите пластину на магнитную стойку и дайте супернатанту очиститься в течение примерно пяти минут. Затем осторожно выбросьте супернатант, не потревожив бусины. Промыть дважды 150 микролитрами 80% этанола, не нарушая бусины.
Вращайте пластину ненадолго в 1000 раз G в течение 30 секунд. Поместите пластину обратно на магнитную стойку с 96 лунками и удалите весь остаточный этанол, не нарушая бусины. Высушите образцы на воздухе в течение двух-пяти минут.
Повторно суспендируют шарики в 37,5 микролитрах 10-миллимолярного гидрохлорида TRIS рН 8 и инкубируют в течение пяти минут при комнатной температуре. Поместите пластину обратно на магнитную стойку и дайте бусинам скрепиться в течение пяти минут. Переложите 36,5 микролитров супернатанта на свежую термоциклер-совместимую 96-луночную пластину и выбросьте бусины.
После проведения оценки качества клеток был изучен внешний вид и процентное содержание клеток, демонстрируя, что не следует использовать низкокачественные эмбриональные стволовые клетки. Одноклеточную сортировку проводили с использованием окрашивания Hoechst 33342, и испытуемые ячейки были подсчитаны, чтобы гарантировать, что в каждой скважине обнаружена либо нулевая, либо одна клетка. Анализ агарозного геля выявил низкомолекулярную лестницу и отдельные одноклеточные библиотеки uliCUT&RUN.
Неоптимальный и оптимальный библиотечный анализ показывает низкомолекулярную лестницу, неоптимальную библиотеку из-за неэффективного переваривания Mnase и успешную библиотеку с соответствующим пищеварением. Распределение анализатора фрагментов показывает, что ожидаемый размер одноячеистой ячейки колеблется от 150 до 500 пар оснований. Однако в крупных белках ДНК будет иметь около 270 пар оснований.
Заполненность белка с использованием однолокусного браузера генома, изображающего высокое количество клеток или отрицательный контроль, и одноклеточный CTCF uliCUT & RUN показал, что одноклеточные в значительной степени представляют собой сильные пики, похожие на высококлеточные uliCUT & RUN. Тепловые карты одноклеточных CTCF или отрицательного контроля выявили четкую картину обогащения чтения непосредственно над установленными сайтами связывания CTCF в клетках. Одномерные тепловые карты показывают более высокую плотность считывания по сравнению с установленными сайтами связывания CTCF в одноклеточных библиотеках по сравнению с окружающими областями и контролем без антител, демонстрируя обогащение антителами в установленных местах связывания.
Уравновешивание связанных шариками ядер на ледяной водяной бане и не перегрев образца при добавлении хлорида кальция важно для предотвращения переваривания хроматина.
