Этот протокол важен, поскольку он показывает хромосомные петли высокого разрешения и другие особенности взаимодействия на близком расстоянии. Основным преимуществом данной методики является картирование 3D организации генома с нуклеосомным разрешением и высоким отношением сигнал/шум. Для выполнения титрования МНазы размораживают одну гранулу от 10 раз до шестых клеток на льду в течение 10 минут, а затем ресуспендируют клетки в 500 микролитрах DPBS и инкубируют клеточную суспензию на льду в течение 20 минут.
Соберите клетки центрифугированием при 10 000 G в течение пяти минут при комнатной температуре и удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулированные ячейки в 500 микролитрах буфера MB Number one. Разморозьте один флакон по 20 единиц на микролитр МНазы и разбавьте его 10 миллимолярным трисом для условий пищеварения, как описано в тексте.
С соответствующими временными интервалами от 10 до 20 секунд добавьте один микролитр первого раствора для разложения MNase в одну из четырех пробирок с образцами, перемешайте и инкубируйте в термомиксере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут при 800 об/мин. Продолжайте добавлять один микролитр из оставшихся разведений MNase в другие аликвоты клеток. Остановите расщепление MNase, добавив 200 микролитров свежеприготовленного стоп-буфера в каждую пробирку в том же порядке и через тот же интервал времени, в котором была добавлена MNase.
Выдерживают при температуре 65 градусов Цельсия в течение двух часов. Добавьте 500 микролитров PCI в каждый образец и тщательно перемешайте путем вихряния. Центрифугу при 19, 800 Г в течение пяти минут при комнатной температуре для разделения фаз.
И перевести водную фазу в новые трубки. Очистите ДНК с помощью коммерческого набора для очистки ДНК в соответствии с инструкциями производителя и элюируйте образцы в 12 микролитров элюирующего буфера. Добавьте от двух до пяти микролитров загрузочного красителя в очищенный образец ДНК.
Запустите образцы на 1,5%-ном агарозном геле и выберите наилучшую степень разложения для эксперимента. Оптимальная степень пищеварения практически не обнаруживает субнуклеосомных фрагментов и составляет от 70 до 90% моно и динуклеосом. В этой репрезентативной выборке была выбрана промежуточная степень разложения между третьей и четвертой дорожками для последующих экспериментов.
На основе титрования MNase расщепляют хроматин, добавляя соответствующее количество MNase в каждую аликвоту образца. Хорошо перемешайте и инкубируйте в термомиксере при температуре 37 градусов Цельсия, 800 об/мин в течение 10 минут. Остановите расщепление MNase, добавив 1,6 микролитра 0,5 молярной EGTA к каждой аликвоте, и инкубируйте в термомиксере при температуре 65 градусов Цельсия в течение 10 минут при встряхивании 800 об/мин.
Соберите пробу центрифугированием при 10 000 G в течение пяти минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендант клеточной гранулы в 500 микролитрах буфера 1X NEB 2.1. Пул образцов эквивалентен входу пять раз по 10 в шестую ячейку или меньше для дальнейшей обработки.
Прежде чем приступить к бесконтактному лигированию, передайте 10% образца в качестве входного контроля для контроля уровня расщепления МНазы. Добавьте 150 микролитров 10 миллимолярных Tris, 25 микролитров 10% SDS и 25 микролитров 20 миллиграммов на миллилитр протеиназы K для контроля пищеварения и инкубируйте в течение ночи при температуре 65 градусов по Цельсию. Соберите оставшуюся пробу центрифугированием при 10 000 G в течение пяти минут при температуре четыре градуса Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость.
Повторно суспендируйте гранулу в 90 микролитрах свежеприготовленной мастер-смеси Micro-C и инкубируйте в термомиксере при температуре 37 градусов Цельсия при 800 об/мин в течение 15 минут. Добавьте 10 микролитров по пять единиц на микролитр фрагмента Кленова и инкубируйте в термомиксере. Затем добавьте 100 микролитров свежеприготовленной мастер-смеси Micro-C.
Инкубируйте в течение 45 минут при температуре 25 градусов Цельсия, 800 об/мин, и гасите ферментативную реакцию ЭДТА, как описано в тексте. Инкубируйте в термомиксере в течение 20 минут при температуре 65 градусов Цельсия, 800 об/мин. Соберите образец центрифугированием при 10 000 G в течение пяти минут при температуре четыре градуса Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость.
Повторно суспендируйте образец в 500 микролитрах свежеприготовленной мастер-смеси Micro-C и инкубируйте в течение 2,5 часов при комнатной температуре при 15-20 об/мин. Повторите центрифугирование и удалите надосадочную жидкость. Затем повторно суспендируйте образец в 200 микролитрах свежеприготовленной мастер-смеси Micro-C и инкубируйте в термомиксере, установленном при температуре 37 градусов Цельсия, в течение 15 минут при 800 об/мин.
Для обратного сшивания и депротеинизации добавьте в образец 25 микролитров 20 миллиграммов на микролитр протеиназы K и 25 микролитров 10%-ного SDS и инкубируйте при температуре 65 градусов Цельсия в течение ночи с прерывистым перемешиванием. Добавьте 500 микролитров PCI к образцам и входному контролю, затем перемешайте путем вихряния. Разделяют фазы центрифугированием при 19 800 G в течение пяти минут и переносят верхнюю водную фазу в свежую пробирку.
Концентрируют ДНК и элюируют образцы в 30 микролитрах, а входной контроль в 15 микролитрах. Запустите 1,5%-ный агарозный гель для разделения мононуклеосом и динуклеосом. Иссеките фрагменты ДНК, которые имеют динуклеосомный размер, и извлеките ДНК, как описано в тексте.
К 150 микролитрам образца добавляют 150 микролитров заранее подготовленных шариков, и выдерживают при комнатной температуре. Поместите пробирки в соответствующий магнит и подождите, пока раствор не выдохнется. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте шарики в 300 микролитрах 1X TBW и повторите этот шаг.
Повторите магнитную сепарацию, а после того, как раствор очистится, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте шарики в 100 микролитрах 0,1X TE. Повторите процедуру и повторите в 50 микролитрах 0,1X TE. Перенесите раствор в пробирки для ПЦР и выполните манипуляции с ДНК, как описано в тексте. После того, как перевязка адаптера завершена, промойте образец в 1X TBW, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте шарики в 20 микролитрах 0,1X TE. Оптимизируйте количество циклов ПЦР и увеличьте библиотеки последовательностей, как описано в тексте. Хроматин из 250 000 клеток за реакцию расщепляли с четырехкратным разведением МНазы.
Самая высокая концентрация, 10 единиц, показала переваренный хроматин, состоящий почти исключительно из мононуклеосомной ДНК. Расщепление 250 000 ЭС-клеток мышей с 0,625 единицами МНазы стало наиболее многообещающей отправной точкой для препаративного пищеварения в экспериментах с микроС. Тем не менее, следует учитывать промежуточную концентрацию MNазы между условиями, показанными на третьей и четвертой линиях, соответствующую пяти единицам на 1 миллион клеток.
Мононуклеосомная полоса с бесконтактной лигацией имела приблизительный размер 300 пар оснований, что аналогично размеру динуклеосом. Таким образом, отношение сигналов моно- и динуклеосомной полос сместилось от преимущественно мононуклеосом к динуклеосомам. Качество и количество подготовленной библиотеки секвенирования оценивали с помощью минимальной ПЦР.
Визуализация показала одну отдельную полосу на 420 парах оснований и отсутствие полос для димеров-адаптеров. В то время как обе выборки в этом исследовании показали высокие показатели карты, хорошая выборка имела более высокую долю цис-чтений. Высокая частота трансхромосомных взаимодействий указывает на случайные события лигирования, хотя некоторые трансхромосомные взаимодействия могут быть важными.
Кроме того, хорошая выборка имела умеренную частоту считывания пар прямого и обратного отображения с расстояниями менее 500 пар оснований. Это указывало на низкую частоту динуклеосом, не расщепленных MNase, имеющих размер, аналогичный двум нуклеосомам, лигированным в непосредственной близости. Правильная степень расщепления MNазы имеет решающее значение для этого эксперимента.
Переваренные нуклеосомы лигируются неэффективно, а недопереваренный хроматин содержит большую долю непереваренных динуклеосом, которые могут загрязнить библиотеку секвенирования. Micro-C можно комбинировать с подходом захвата для картирования локус-специфичной организации генома с чрезвычайно высоким разрешением.
