Этот протокол точно обнаруживает особенности сворачивания хромосом в нескольких масштабах длины с низким фоновым сигналом. Например, промоторные энхансерные взаимодействия могут быть проанализированы в контексте хромосомных компартментов. Использование рестрикционных эндонуклеаз позволяет оптимизировать уровень переваривания входного материала.
Для улавливания продуктов лигирования не требуется отбор по гелевой изоляции. Наиболее распространенной проблемой является потеря клеток после фиксации DSG и захвата достаточного количества ДНК для создания высококачественных библиотек. Для начала аспирируйте среду пипеткой Пастера, соединенной с вакуумной ловушкой, от 150-миллиметровой пластины, содержащей 5 на 10, до шестой ячейки.
Дважды промыть клетки 10 миллилитрами HBSS. Чтобы сшить клетки, насыпьте 23,125 миллилитра 1%-ного раствора формальдегида в 15-сантиметровую пластину. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут, осторожно раскачивая тарелку вручную каждые две минуты.
Затем добавьте 1,25 миллилитра 2,5-молярного глицина и осторожно закрутите пластину, чтобы погасить реакцию сшивки, прежде чем инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Продолжайте инкубацию на льду в течение 15 минут, чтобы остановить сшивание. Соскоблите ячейки с пластины с помощью скребка для ячеек или резинового полицейского и перенесите суспензию ячейки в 50-миллилитровую коническую трубку с пипеткой.
Центрифугируют суспензию в 1 000 раз G в течение 10 минут при комнатной температуре и выбрасывают супернатант путем аспирации. Вымойте гранулу один раз 10 миллилитрами фосфатно-буферного физиологического раствора Dulbecco или DPBS. Затем снова центрифугируйте, прежде чем перейти к сшиванию DSG.
Для сшивания с DSG повторно суспендируют гранулированные ячейки в 9,9 миллилитрах DPBS. Затем добавьте 100 микролитров 300-миллимолярного DSG. Перемешайте трубку путем инверсии и сшивайте ячейки при комнатной температуре в течение 40 минут на ротаторе.
После сшивки добавьте 1,925 миллилитра 2,5-молярного глицина, переверните для смешивания и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем центрифугируют клетки в 2000 раз G в течение 15 минут и повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре 0,05% бычьего сывороточного альбумина DPBS перед переносом его в 1,7-миллилитровую трубку. Центрифугируйте клетки в 2000 раз G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия и выбросьте супернатант.
Заморозьте гранулу в жидком азоте, прежде чем приступить к захвату подтверждения хромосомы. Повторно суспендируют сшитую клеточную аликвоту в одном миллилитре буфера ледяного лизиса, содержащего 10 микролитров коктейля ингибитора протеазы, и переносят в гомогенизатор Доунса в течение 15 минут инкубации на льду. Медленно перемещайте пестик А вверх и вниз 30 раз, чтобы гомогенизировать клетки и инкубировать в течение одной минуты, чтобы позволить клеткам остыть еще до 30 ударов.
После последнего удара перенесите лизат в 1,7-миллилитровую трубку. Центрифугируйте лизированную суспензию в 2 500 раз G в течение пяти минут. Выбросьте супернатант и щелкните или вихрь, чтобы повторно суспендировать влажную гранулу.
Удалите как можно больше надосадочного вещества, чтобы получить йогуртоподобное вещество с минимальными сгустками. Перед центрифугированием гранулы повторно суспендируют в 500 микролитрах ледо-холодового рестрикционного буфера. После второй промывки повторно суспендируют гранулу в 360 микролитрах рестрикционного буфера путем пипетирования после добавления примерно 340 микролитров к переходящего объему гранулы, в зависимости от размера ячейки.
Отложите 18 микролитров лизата для проверки целостности хроматина или CI.To оставшийся лизат, добавьте 38 микролитров 1% додецилсульфата натрия в трубку hi-C, чтобы получить общий объем 380 микролитров и тщательно перемешайте путем пипетирования без введения пузырьков. Инкубируйте образцы при температуре 65 градусов Цельсия без встряхивания в течение 10 минут, чтобы открыть хроматин. Затем сразу же поместите трубку на лед.
После приготовления смеси для пищеварения с Тритоном Х-100 добавляют 107 микролитров этой смеси в трубку hi-C, чтобы получить общий объем 487 микролитров и переваривают хроматин в течение ночи при 37 градусах Цельсия в термомиксере с интервальным встряхиванием. На следующий день переведите образцы до 65 градусов цельсия в течение 20 минут, чтобы деактивировать оставшуюся активность эндонуклеазы. После помещения образца на лед отложите 10 микролитров контроля пищеварения, или постоянного тока, и храните их при четырех градусах Цельсия.
Снимите конденсат с крышки пипеткой или спиннингом. Затем добавьте 58 микролитров биотиновой смеси, чтобы получить общий объем 535 микролитров. Пипетку осторожно не образуя пузырьков перед насиживанием при 23 градусах Цельсия в течение четырех часов в термомиксоре.
После инкубации добавляют 665 микролитров лигационной смеси, делая объем образца 1,200 микролитра. Перемешайте образец путем пипетирования и инкубируйте при температуре 16 градусов Цельсия в течение четырех часов в термомикшере. Затем добавьте 50 микролитров протеиназы-К в двух фракциях в пробирку для образцов hi-C и инкубируйте в течение ночи при 65 градусах Цельсия с интервальным встряхиванием.
Для очистки ДНК добавьте 100% ледяной этанол и центрифугируйте пробирки в 18 000 раз G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Полностью удалите супернатант со стороны, не содержащей гранул, и высушите образец на воздухе в течение 10 минут или до тех пор, пока гранулы не высохнут. Как только гранулы высохнут, солюбилизируйте их в 450 микролитрах Tris с низким ЭДТА путем пипетирования или закручивания.
Перенесите солюбилизированную суспензию на 0,5-миллиметровый центробежный фильтрующий блок, или КОЕ, с трехкилодальтонной отсечкой молекулярной массы. Центрифугируйте КОЕ на максимальной скорости в течение 10 минут и отбрасывайте проточную. После второй промывки добавьте в колонку 80 микролитров Tris low-EDTA.
Превратите колонну в новую коллекторную трубку для двух минут центрифугирования на максимальной скорости. Наконец, загрузите образцы на гель с содержанием агарозы 0,8%. Агарозный гель с результатами титрования ПЦР показал, что большинство библиотек требуют от пяти до восьми циклов окончательной амплификации ПЦР.
Клеточное переваривание конечной амплифицированной библиотеки ПЦР, наблюдаемое более мелкими фрагментами на агарозном геле, подтверждает наличие надлежащих лигационных соединений и служит проверкой качества перед секвенированием. После секвенирования картографированные данные показали, что комбинация DpnII и DdeI значительно увеличивает контакты на коротких расстояниях, так как добавление DSG к обычному сшивке формальдегида. Улучшенный сигнал также можно наблюдать на больших и коротких расстояниях непосредственно от 2D-матриц взаимодействия.
Сигналы отсека CRISPR на больших расстояниях, а точки, образованные петлями хроматина, более заметны на коротких расстояниях. В дополнение к формальдегиду, сшивание с DSG уменьшает случайные лигации, улучшая относительный охват в цис. Важно не терять клетки во время и после сшивания.
Гранулы клеток могут быть рыхлыми или невидимыми, а клетки могут прилипать к кончикам пипетки в некоторых буферах.
