Данная методика позволяет исследовать механическое поведение эритроцитов, характеризуя их вязкоупругие параметры и мягкие стекловидные свойства для ряда физиологических и патологических состояний. Наш одноклеточный метод проверяет видеоэталоны, используя значения металла для форм-фактора, который связывает силы и смещения, напряжения и царапины на поверхности эритроцитов. Начните с того, что нанесите силиконовую смазку на поверхность резинового кольца таким образом, чтобы покрыть весь периметр.
Затем поместите резиновое кольцо на покровное стекло жирной стороной, обращенной к покровному стеколю. Подождите пять минут для правильного прикрепления, и держатели образцов будут готовы к приему клеточной культуры. Затем раствором клеток, предварительно приготовленным в соответствии с письменным протоколом, высевают клетки в держатель образца.
Добавьте в образец 0,2 микролитра 10%-ного объемного раствора полистирольной сферы. Поместите второе покровное стекло над резиновым кольцом. Закройте установку и завершите пробоподготовку.
Наконец, переместите весь образец в микроскоп. Чтобы начать экспериментировать, используйте систему OT, захватите сферу с помощью лазера OT, а затем прикрепите ее к покровному стеклу, близко к ячейке. Затем захватите другую сферу и повторите ту же процедуру прикрепления, прижав сферу к поверхности ячейки, рядом с верхней поверхностью и близко к краю ячейки.
Добавьте синусоидальную функцию амплитуды и переменных частот. Затем нажмите кнопку «Пуск», используя пьезоэлектрический каскад, чтобы разрешить пьезоэлектрическое смещение. Держите сферу эритроцитов в ловушке и отправьте образец в цикл движений, используя ранее установленную синусоидальную функцию.
Для анализа откройте программное обеспечение ImageJ и импортируйте весь фильм, полученный во время синусоидальных движений. Нажмите «Настроить», а затем выберите порог опции. Отрегулируйте порог с помощью обеих полос прокрутки и выберите эталонную сферу, щелкнув файл, а затем прямоугольник.
Затем на вкладке «Анализ» нажмите «Установить измерения»и выберите центр масс»вариант. Нажмите еще раз на вкладку «Анализ» и выберите «Анализировать частицы». Появится новое окно, содержащее таблицу с координатами xy для центра масс.
Повторите процедуру для другой сферы, прикрепленной к поверхности эритроцитов. Откройте программное обеспечение для анализа и импортируйте ранее полученные текстовые файлы. Сгенерируйте график с центрами масс по оси Y и временем по оси x.
Нанесите результаты на график, используя ось x для константы потерь, обозначаемую двойным простым числом K, и ось y для постоянной хранения, обозначаемую простым числом K. Во-первых, для получения видео переместите пьезоэлектрический столик в направлении xy, используя программное обеспечение для поиска изолированной ячейки, прикрепленной к покровному стеклу. Улавливаем и прикрепляем к поверхности эритроцитов полистирольный шар известного диаметра.
Затем, используя пьезоэлектрический столик, переместите захваченный шарик, прикрепленный к поверхности эритроцитов, чтобы деформировать ячейку, а затем прикрепите шарик к кромке. Теперь измените положение оси Z, чтобы найти сфокусированное изображение. После фиксации положения используйте программное обеспечение камеры, чтобы создать видеоролик всей ячейки.
Затем переместите положение по оси Z на два микрометра вниз или вверх, чтобы получить расфокусированное изображение для выбранной ячейки. Наконец, не изменяя положение оси Z, найдите область без ячеек, чтобы повторить ту же процедуру, и создайте видеоролик фона изображения. Для получения контрастного изображения сначала найдите значение N ноль, нажмите на значок выбора полигона, затем перейдите на вкладку анализа и выберите измерение.
Затем используйте уравнение контраста, чтобы определить N изображений минус N ноль, и выполните это, выбрав math «в процессе» с последующим вычитанием. Позже разделите результат на N ноль минус B.Наконец, найдите контраст для сфокусированных и расфокусированных изображений. Теперь используйте преобразование Хартли, чтобы получить толщину эритроцитов.
В ImageJ нажмите «Процесс», затем «БПФ» и «Параметры БПФ», а затем выберите «FHT». Затем выполните обратное преобразование FHT, выбрав процесс, а затем FFT и FFT. Используйте полученное изображение для получения профиля высоты.
После нахождения изображения, содержащего профиль высоты эритроцитов, используйте два микрометра расфокусированного контраста, чтобы создать набор из двух изображений в ImageJ. Чтобы найти форм-фактор, используйте настраиваемый макрос ImageJ для анализа стека. Макрос выдаст таблицу с положением ребра, периметром, обратным периметру и изображением анализируемой ячейки.
Проверьте, похожи ли края этого изображения на края эталонного рисунка. В противном случае повторите процедуру и используйте сумму обратного периметра для нахождения форм-фактора. Начните с организации экспериментальных данных в таблице.
Создайте новую таблицу в аналитическом программном обеспечении, щелкнув вкладку файла. Определите 10 различных столбцов для параметров. Чтобы построить кривую G prime и G double prime в аналитическом программном обеспечении, используйте данные из предыдущей таблицы и нажмите на кнопку «график».
Чтобы получить параметры Gamma и GM, нажмите на вкладку Curve Fit и выберите fit1", чтобы открыть новое окно. Выберите квадрат, нажмите кнопку определения и введите уравнение. Нажмите на кнопку «ОК» в обоих окнах, и появится примерка.
Затем создайте два других графика, а именно простое число G и двойное простое число G в зависимости от омеги. Размещайте полосы погрешности только на оси Y, как было показано ранее. Повторите процедуру подгонки кривой, выберите опцию G.
Щелкните определение кривой» в разделе «Общая подгонка», а затем напишите соответствующее уравнение. Наконец, нажмите «ОК», и появится подгонка кривой вместе со значениями для альфа и G ноль. Опять же, выполните еще одну процедуру подгонки кривой.
Выберите G"вариант, нажмите определение кривой"в разделе "Общая подгонка", а затем напишите соответствующее уравнение. Наконец, нажмите «ОК», и появится подгонка кривой. На рисунке показана эластичная константа хранения в зависимости от упругой константы потерь.
Наблюдаемая линейная зависимость показывает, что поверхность эритроцитов можно считать мягким стеклообразным материалом. Применяя значения для общего форм-фактора ячейки и толщины поверхности эритроцитов, можно определить значения показателя степени Альфа. Этот метод может стать основой для новых методов диагностики, которые коррелируют изменения вязкоупругих свойств эритроцитов с изменениями кровотока у лиц с различной патологией.
