광학 핀셋과 디포커싱 현미경을 사용한 적혈구의 점탄성 특성에 대한 정량적 분석

이 방법론은 적혈구의 기계적 거동을 탐구하여 여러 생리적 및 병리학 적 조건에 대한 점탄성 매개 변수와 부드러운 유리 기능을 특성화합니다. 당사의 단일 셀 기반 방법은 적혈구 표면의 힘과 변위, 응력 및 긁힘과 관련된 폼 팩터에 대한 금속 값을 사용하여 비디오 참조를 확인합니다. 전체 둘레를 덮는 방식으로 고무 링 표면에 실리콘 그리스를 붓는 것으로 시작합니다.

그런 다음 그리스 면이 커버슬립을 향하도록 고무 링을 커버슬립에 놓습니다. 적절한 부착을 위해 5분 동안 기다리면 샘플 홀더가 세포 배양을 받을 준비가 됩니다. 다음으로, 작성된 프로토콜에 따라 미리 준비된 세포 용액을 사용하여 샘플 홀더에 세포를 시드합니다.

0.2 마이크로리터의 10 부피% 폴리스티렌 구 용액을 샘플에 첨가한다. 두 번째 커버슬립을 고무 링 위에 놓습니다. 설정을 닫고 샘플 준비를 마칩니다.

마지막으로 전체 샘플을 현미경으로 옮깁니다. 실험을 시작하려면 OT 시스템을 사용하고 OT 레이저로 구체를 가둔 다음 셀에 가까운 커버 슬립에 부착합니다. 그런 다음 다른 구를 트랩하고 구를 셀 표면, 상단 표면 근처 및 셀 가장자리 가까이로 눌러 동일한 부착 절차를 반복합니다.

진폭과 다양한 주파수의 정현파 함수를 추가합니다. 그런 다음 압전 스테이지를 사용하여 시작 버튼을 눌러 압전 변위를 허용합니다. RBC 구를 트랩에 보관하고 이전에 설정된 정현파 함수를 사용하여 샘플을 이동 주기에 제출합니다.

분석을 위해 ImageJ 소프트웨어를 열고 정현파 이동 중에 얻은 전체 동영상을 가져옵니다. adjust(조정)를 클릭한 다음 옵션 임계값(option threshold)을 선택합니다. 두 스크롤 막대로 임계값을 조정하고 파일을 클릭한 다음 사각형을 클릭하여 참조 구를 선택합니다.

그런 다음 분석 탭에서 측정 설정"을 클릭하고 질량 중심을 선택합니다." 옵션을 선택합니다. 분석(analyze) 탭을 다시 클릭하고 파티클 분석(analyze particles)을 선택합니다. 질량 중심에 대한 xy 좌표가 있는 테이블이 포함된 새 창이 나타납니다.

RBC 표면에 부착된 다른 구에 대해 이 절차를 반복합니다. 분석 소프트웨어를 열고 이전에 얻은 txt 파일을 가져옵니다. 질량 중심이 y축에 있고 시간이 x축에 있는 플롯을 생성합니다.

손실 상수에 대한 x축(K 이중 소수로 표시됨)과 저장 상수에 대한 y축(K 소수로 표시됨)을 사용하여 그래프에 결과를 플로팅합니다. 먼저, 비디오 획득을 위해 압전 스테이지를 xy 방향으로 이동하고 소프트웨어를 사용하여 커버슬립에 부착된 절연 셀을 검색합니다. 알려진 직경의 폴리스티렌 구체를 RBC 표면에 걸러서 부착합니다.

다음으로, 압전 스테이지를 이용하여 RBC 표면에 부착된 포획된 비드를 이동하여 셀을 변형시킨 다음 비드를 커버립에 부착합니다. 이제 z축 위치를 변경하여 초점이 맞춰진 이미지를 찾습니다. 위치를 고정한 후 카메라 소프트웨어를 사용하여 전체 셀의 동영상을 만듭니다.

그런 다음 z축 위치를 2마이크로미터 아래 또는 위로 이동하여 선택한 셀에 대한 초점이 흐려진 이미지를 얻습니다. 마지막으로 z축 위치를 변경하지 않고 셀이 없는 영역을 검색하여 동일한 절차를 반복하고 이미지 배경의 동영상을 만듭니다. 대비 이미지 획득의 경우 먼저 N 0의 값을 찾고 다각형 선택 아이콘을 클릭한 다음 분석 탭을 클릭하고 측정을 선택합니다.

다음으로, 대비 방정식을 사용하여 N 이미지에서 N 0을 뺀 값을 결정하고, 프로세스에서 수학을 선택한 다음 빼기를 선택하여 이를 실행합니다. 나중에 결과를 N 0에서 B를 뺀 값으로 나눕니다. 마지막으로 초점이 맞춰진 이미지와 초점이 맞지 않는 이미지의 대비를 찾습니다. 이제 Hartley 변환을 사용하여 RBC 두께를 구합니다.

ImageJ에서 프로세스를 클릭 한 다음 FFT "및 FFT 옵션을 클릭 한 다음 FHT를 선택합니다. 그런 다음 프로세스를 선택한 다음 FFT"및 FFT를 선택하여 역 변환 FHT를 수행합니다. 결과 이미지를 사용하여 높이 프로파일을 얻습니다.

RBC 높이 프로필이 포함된 이미지를 찾은 후 2마이크로미터의 초점이 흐려진 대비를 사용하여 ImageJ에 두 개의 이미지 집합을 만듭니다. 폼 팩터를 찾으려면 ImageJ 사용자 지정 매크로를 사용하여 스택을 분석합니다. 매크로는 가장자리의 위치, 둘레, 둘레의 역 및 분석된 셀의 이미지가 포함된 테이블을 제공합니다.

이 이미지의 가장자리가 참조 그림의 가장자리와 유사한지 확인하십시오. 그렇지 않으면 절차를 반복하고 둘레의 역수의 합을 사용하여 폼 팩터를 찾습니다. 먼저 실험 데이터를 표로 구성합니다.

파일 탭을 클릭하여 분석 소프트웨어에서 새 테이블을 만듭니다. 매개변수에 대해 10개의 서로 다른 열을 결정합니다. 분석 소프트웨어에서 곡선 G 프라임 및 G 이중 프라임을 플로팅하려면 이전 테이블의 데이터를 사용하고 플롯 버튼을 클릭하십시오.

매개변수 감마(Gamma) 및 GM(GM)을 얻으려면 곡선 맞춤(curve fit) 탭을 클릭하고 fit1"을 선택하여 새 창을 엽니다. 사각형을 선택하고 정의 버튼을 클릭한 다음 방정식을 입력합니다. 두 창에서 확인" 버튼을 클릭하면 피팅이 나타납니다.

다음으로, 두 개의 다른 플롯, 즉 오메가의 함수로 G 프라임과 G 이중 프라임을 만듭니다. 앞에서 설명한 대로 오차 막대를 y축에만 배치합니다. 커브 피팅 절차를 반복하고 G" 옵션을 선택합니다.

일반 맞춤에서 곡선 정의"를 클릭한 다음 해당 방정식을 작성합니다. 마지막으로 확인을 클릭하면 알파 및 G 0 값과 함께 곡선 피팅이 나타납니다. 다시 다른 커브 피팅 절차를 수행합니다.

G"옵션을 선택하고 일반 맞춤에서 곡선 정의"를 클릭한 다음 해당 방정식을 작성합니다. 마지막으로 확인을 클릭하면 곡선 피팅이 나타납니다. 그림은 손실 탄성 상수의 함수로서 저장 탄성 상수를 보여줍니다.

관찰된 선형 의존성은 RBC 표면이 부드러운 유리 물질로 간주될 수 있음을 보여줍니다. 전체 셀 폼 팩터 및 RBC 표면 두께에 대한 값을 적용하여, 지수 알파에 대한 값이 결정될 수 있다. 이 기술은 적혈구의 점탄성 특성의 변화와 다른 병리를 가진 개인의 혈류 변형을 연관시키는 새로운 진단 방법의 기초를 제공할 수 있습니다.