光ピンセットとデフォーカス顕微鏡を用いた赤血球の粘弾性特性の定量的解析

この方法論は、赤血球の機械的挙動を探索することを可能にし、それらの粘弾性パラメータおよびいくつかの生理学的および病理学的状態に対する柔らかいガラス状の特徴を特徴付ける。当社のシングルセルベースの方法は、赤血球表面の力と変位、応力と擦り傷を関連付けるフォームファクターの金属値を使用して、ビデオ参照を検証します。まず、ゴムリングの表面にシリコングリースをかけて、周囲全体を覆うようにします。

次に、グリース側をカバーガラスに向けて、カバーガラスにゴムリングを置きます。正しく取り付けられるまで5分間待つと、サンプルホルダーは細胞培養を受け入れる準備が整います。次に、書面によるプロトコールに従って予め調製した細胞の溶液を用いて、細胞をサンプルホルダーに播種する。

0.2マイクロリットルの10体積%体積ポリスチレン球溶液をサンプルに加えます。2番目のカバーガラスをゴムリングの上に置きます。セットアップを閉じ、サンプル調製を終了します。

最後に、サンプル全体を顕微鏡に移します。実験を開始するには、OTシステムを使用し、OTレーザーで球をトラップしてから、セルの近くのカバーガラスに取り付けます。次に、別の球をトラップし、球を細胞表面、上面近く、細胞端近くに押し付けて、同じ付着手順を繰り返します。

振幅と変化する周波数の正弦波関数を追加します。次に、圧電ステージを使用して圧電変位を可能にするスタート"ボタンを押します。RBC球をトラップに保持し、以前に設定した正弦波関数を使用してサンプルを動きのサイクルに提出します。

分析のために、ImageJソフトウェアを開き、正弦波運動中に得られたムービー全体をインポートします。調整をクリックし、オプションのしきい値を選択します。両方のスクロールバーでしきい値を調整し、ファイルをクリックしてから長方形をクリックして参照球を選択します。

次に、[分析]タブで、[測定値の設定]をクリックします「重心を選択します」オプション。[解析]タブをもう一度クリックし、[パーティクルの解析]を選択します。質量の中心のxy座標を含むテーブルを含む新しいウィンドウが表示されます。

RBC サーフェスにアタッチされている他の球に対してこの手順を繰り返します。解析ソフトウェアを開き、以前に取得したtxtファイルをインポートします。重心をy軸、時間をx軸とするプロットを生成します。

K倍素数で示される損失定数のx軸と、K素数で示される貯蔵定数のy軸を使用して、結果をグラフにプロットします。まず、ビデオ取得のために、ソフトウェアを使用してカバーガラスに取り付けられた単離されたセルを検索し、圧電ステージをxy方向に動かします。既知の直径のポリスチレン球をトラップしてRBC表面に取り付けます。

次に、圧電ステージを使用して、RBC表面に付着したトラップビーズを移動させてセルを変形させた後、ビーズをカバーリップに取り付けます。次に、z軸の位置を変更して、焦点が合った画像を見つけます。位置を固定したら、カメラソフトウェアを使用してセル全体の動画を作成します。

次に、z 軸の位置を 2 マイクロメートル下または上に移動して、選択したセルの焦点が合っていない画像を取得します。最後に、z軸の位置を変えずに、同じ手順を繰り返して細胞のない領域を探し、画像の背景の動画を作成します。コントラスト画像を取得するには、最初にNゼロの値を見つけ、ポリゴン選択アイコンをクリックしてから、[分析]タブをクリックして[測定]を選択します。

次に、コントラスト方程式を使用してN個の画像からN個のゼロを引いたものを決定し、これを「処理中の数学」を選択してから減算して実行します。後で、結果をNゼロからBを引いたもので割ります.最後に、焦点が合った画像と焦点が合っていない画像のコントラストを見つけます。次に、ハートレー変換を使用して RBC の厚さを取得します。

ImageJで、プロセスをクリックし、次にFFT"およびFFTオプションをクリックしてから、FHTを選択します。次に、プロセスを選択して逆変換FHTを実行し、続いてFFT"とFFTを実行します。結果の画像を使用して、高さプロファイルを取得します。

RBC 高さプロファイルを含む画像を見つけたら、2 マイクロメートルの焦点の合ったコントラストを使用して、ImageJ で 2 つの画像のセットを作成します。フォーム ファクターを見つけるには、ImageJ でカスタマイズされたマクロを使用してスタックを分析します。マクロは、エッジの位置、周長、周長の逆数、および分析されたセルの画像を含むテーブルを提供します。

この画像のエッジが参照図のエッジと似ているかどうかを確認してください。それ以外の場合は、手順を繰り返し、周囲の逆数の合計を使用してフォーム ファクターを見つけます。まず、実験データを表に整理します。

ファイルタブをクリックして、分析ソフトウェアで新しいテーブルを作成します。パラメータの 10 個の異なる列を決定します。解析ソフトウェアで曲線G素数とG二重素数をプロットするには、前の表のデータを使用して、プロットボタンをクリックします。

パラメータガンマとGMを取得するには、カーブフィットタブをクリックし、fit1"を選択して新しいウィンドウを開きます。正方形を選択し、定義ボタンをクリックして、方程式を入力します。クリックしてください 大丈夫"両方のウィンドウのボタンをクリックすると、フィッティングが表示されます。

次に、オメガの関数としてG素数とGダブル素数の2つのプロットを作成します。前に示したように、エラーバーはy軸にのみ配置します。カーブフィット手順を繰り返し、G"オプションを選択します。

一般適合の下の「曲線定義」をクリックし、関連する方程式を記述します。最後に、[OK]をクリックすると、アルファとGゼロの値とともにカーブフィッティングが表示されます。ここでも、別のカーブフィット手順を実行します。

G"オプションを選択し、一般的なフィットの下の曲線定義をクリックして、関連する方程式を記述します。最後に、[OK]をクリックすると、カーブフィッティングが表示されます。この図は、損失弾性定数の関数としての貯蔵弾性定数を示しています。

観察された線形依存性は、RBC表面が柔らかいガラス状材料と見なすことができることを示しています。セル全体のフォーム ファクターと RBC 表面の厚さの値を適用することで、指数 Alpha の値を決定できます。この技術は、赤血球の粘弾性特性の変化と異なる病状を持つ個人の血流の変化を相関させる新しい診断方法の基礎を提供する可能性があります。