Этот метод позволяет измерить пространственное временное распределение сил, применяемых клетками В при иммунной синапсе, и соотнести их с набором конкретных белков. Силовая микроскопия тяги с использованием полиакриламинидных гелей проста в реализации. Этот протокол может быть использован для быстрой настройки измерения механических возможностей многих В-клеток.
Этот метод является гибким и может быть адаптирован к графику других лигандов, как интегрины или для изучения других видов иммунных синапсов, как Т-клетки или разочарование фагоцитоза. Из-за физических и химических свойств гелей, требуемых этим экспериментом, адаптация классических методов силовой микроскопии тяги к клеткам группы В может быть сложной. Начните с засолинизации поддержки геля.
Активируйте крышку или стеклянную нижнюю чашку Петри с уф-лампой в течение двух минут, затем засолйте ее 200 микролитров APTMS в течение пяти минут. Это подготовит поддержку ковалентной привязки геля. Тщательно мыть крышку или стеклянное дно блюдо с ультра чистой водой и высушить его с помощью вакуумной аспирации.
Чтобы подготовить крышки для уплощения геля, положить их в керамический держатель крышки, положить держатель в небольшой стакан, и залить силиконизации реагента над coverslips убедившись, чтобы покрыть их полностью. Накройте стакан алюминиевой фольгой и оставьте его при комнатной температуре на три минуты. Между тем, заполнить большой стакан с ультра чистой водой.
После трех минут инкубации в силиконовом реагенте, перенесите держатель крышки с крышками в стакан с водой. Тщательно промыть крышки с ультра чистой водой. Высушите их хорошо и поместите их на бумажные салфетки.
Для получения наилучших результатов немедленно приступайте к полимеризации геля. Подготовь 500 гель Паскаля предварительно перемешать в соответствии с рукописными направлениями, а затем объединить 167 микролитров предварительно смешать с 1,67 микролитров бисера. Вихрь и sonicate смесь в ванне sonicator в течение пяти минут.
Защитите смесь от света алюминиевой фольгой. Чтобы извлечь выгоду из полимеризации, добавьте 1,67 микролитров 10%аммония persulfate в смесь геля, а затем инициировать полимеризацию, добавив 0,2 микролитров TEMED и смешивая гель с пипеткой. Чтобы бросить гель, пипетка девять микролитров гель смеси на каждый соленой крышкой или стеклянное дно блюдо.
Немедленно сгладить гель с силиконовой крышкой, нажав на него с щипся, чтобы убедиться, что гель распространяется по всей площади крышки и что некоторые из них вытекает. Инвертировать крышку или стеклянную нижнюю тарелку в большую чашку Петри и нажмите его на скамейке, чтобы заставить бисер к поверхности геля. Поместите увлажненной ткани на блюдо, чтобы создать влажную камеру.
Обложка его алюминиевой фольгой и инкубировать его в течение одного часа. После инкубации облегчите высвобождение крышки, добавив PBS в образец. Аккуратно удалите крышку с помощью иглы, слегка наклоняя блюдо, но убедившись, что гель погружен в PBS.
Силиконизирующий агент, акриламид, базовый акриламид и TEMED могут быть токсичными при вдыхании. Носите стандартное средства индивидуальной защиты и манипулировать этими продуктами под химическим капотом. Аспирировать PBS из гелей и добавить 150 микролитров Сульфо-САНПА при комнатной температуре.
Выставить гель для УФ-лечения в течение двух минут, а затем мыть гель три раза с PBS. Повторите лечение сульфо-SANPAH и PBS моет, а затем добавить 250 микролитров куриного яйца лизозима или HEL к гелю и инкубировать его на ночь в камере влажности при четырех градусах по Цельсию покрыты алюминиевой фольгой. После инкубации снимите антиген HEL и трижды промойте гель PBS.
Наконец, накройте гель 500 микролитров В-клеточных культур и оставьте его при комнатной температуре. Используйте конфокальный микроскоп с тепловым и углекислым газом для визуализации. Аспирировать средства массовой информации из геля, оставив около 200 микролитров.
Распоить гель на микроскопе. Два основных слоя бисера появятся на дне и верхней части геля. Сосредоточьтесь на плоскости геля и найдите овеную область для изображения.
Тщательно выберите область изображения и убедитесь, что оставаться в центре внимания. Соответствующая плотность бисера и овеженная поверхность являются ключом к получению надежных и надежных измерений силы. Добавьте 80 микролитров первичных лимфоцитов B от мышей MD4 к гелю, избегая прикосновения к гелю, чтобы сохранить фокус.
Убедитесь, что фокус по-прежнему корректен и что клетки можно увидеть спускаясь в этом районе. Запустите приобретение до того, как клетки достигнут геля. Откройте фильм в качестве стопки изображений в ImageJ, а затем запустить макро cropandsave.ijm.
Выберите каталог вывода и настройте настройки канала атрибутов. Выберите области, представляющие интерес, с помощью прямоугольника и добавьте их в список рентабельности инвестиций с помощью ключа T. Когда закончите, нажмите OK. Когда макрос предлагает маску ячейки, нажмите OK, если она является удовлетворительной.
Если это неудовлетворительно, нажмите не ОК, а затем вручную выберите закрытый регион с любым инструментом выбора, а затем нажмите продолжить. Откройте MATLAB и запустите tfmv1.m. Вввеми необходимые параметры.
В частности, проверьте свойства изображения, такие как размер пикселей и интервал времени приобретения и свойства геля, такие как коэффициент Young modulus E и Poisson. После завершения поиска выходных данных программного обеспечения в том же каталоге, что и исходный файл. Правильные изображения бисера выглядят как равномерное и случайное распределение ярких пятен, похожих на звездное небо.
Данные и анализ не являются надежными, когда количество бусинок слишком низко или изображение находится вне фокуса. Наблюдать за движением бисера глазами можно с помощью эталонного кадра, который предшествовал первому контакту клетки с субстратом. Приблизительные результаты можно получить с помощью отслеживания отдельных частиц.
Анализ обеспечивает сегментацию бусин в эталонное изображение в качестве контроля. Используя программное обеспечение, можно также получить смещения и стресса поле, которое является вектором локального стресса на каждом пикселе и каждый момент времени. Scalar продукт смещения и силовых полей, интегрированных на площади ячейки обеспечивает общую работу, оказываемую ячейкой на субстрате.
При сравнении двух биологических условий можно рассчитать среднюю кривую или среднее значение за последний раз, когда энергия достигает плато. Когда пространственная информация сил актуальна, также можно сравнить одиночные точки времени каждого состояния. Пример флуоресценции антигена извлечения промежуток времени показан здесь.
Прогрессивное появление флуоресцентных сигналов в синапсе указывает на отслоение антигена от геля. Данные флуоресценции могут быть использованы для построения средней кривой извлечения. Наиболее деликатным шагом в протоколе является полимеризация геля под крышкой.
Этот шаг должен быть выполнен относительно быстро и тщательно, гарантируя, что гель сжимается равномерно под крышкой. После этой процедуры флуоресцентный белок, выражаюющий В-лимфоциты, может быть использован для одновременной оценки локализации внутриклеточных структур и силового узора. Этот метод может быть объединен с генетическими или химическими возмущениями для оценки роли конкретных белков на клеточной контрактности и поглощении антигена.
