Мигрирующая саранча является важным сельскохозяйственным испытанием. Этот метод обеспечивает эффективный и простой в использовании протокол для методов генного давления Это систематический и подробный метод построения CRISPR/CAS9 гомозиготных мутантов саранчи, включая сбор яйцеклеток, скрининг мутантов и поддержание гомозиготности. Для начала подготовьте инъекционные иглы, потянув стеклянные капилляры с помощью микропипетки.
Установите параметры, как описано в текстовой рукописи, затем отшлифуйте кончик инъекционной иглы микроболгаркой. Подготовьте рибонуклеопротеин для инъекции, смешав один микролитр белка Cas9 с одним микролитром верифицированной однонаправляющей РНК. Затем добавьте восемь микролитров свободной стерильной воды РНК, чтобы получить окончательный объем смеси 10 микролитров.
Тщательно перемешайте раствор и поместите его на лед. Затем соберите свежеотложенные яичные стручки из яйцеклетки и дождитесь дубления яиц. Через 30 минут используйте тонкую щетку, чтобы изолировать яйца от стручков яиц в воде, и трижды промойте яйца стерильной водой.
Затем поместите яйца в чашку Петри и добавьте стерильную воду, чтобы они оставались влажными. Заполните инъекционную иглу приготовленным раствором рибонуклеобелка и загрузите инъекцию в микроманипулятор. Установите параметры микровпрыска как 300 гектопаскалей давления впрыска, 0,5 секунды времени впрыска и 25 гектопаскалей компенсационного давления.
Когда параметры установлены, нажмите на педаль, чтобы оценить объем вводимого раствора. Отрегулируйте давление впрыска и время впрыска, чтобы объем впрыска составлял от 50 до 100 нанолитров. После регулярного размещения стерильных яиц на инъекционной подушке поместите прокладку на стол для объектов микроскопа и отрегулируйте увеличение микроскопа до тех пор, пока яйца не будут наблюдаться.
Затем отрегулируйте иглу для микроинъекций под микроскопом до тех пор, пока не станет виден наконечник инъекции, и расположите наконечник рядом с вводимой яйцеклеткой. Начните инъекцию на подходящей высоте и под углом от 30 до 45 градусов. Вставьте наконечник в яйцо рядом с микростопками яйца и нажмите педаль, чтобы выполнить инъекцию.
Затем быстро втяните иглу и переместите инъекционную подушечку для инъекции следующего яйца. Переложите введенные яйца в культуральную чашку с кусочком влажной фильтровальной бумаги. Поместите их в инкубатор при температуре 30 градусов по Цельсию.
После инъекции проверяйте развитие введенных яйцеклеток каждый день. Переносите введенные яйца в новую культуральную чашку каждые 24 часа в течение первых пяти дней. На шестой день после инъекции случайным образом соберите и перенесите 10 яиц в пробирку и адекватно измельчите яйца двумя стальными шариками с частотой 60 герц в течение шести минут с помощью кофемолки.
После измельчения ресуспендируйте мусор в одном миллилитре PBS. Затем переведите пять микролитров ресуспендированной смеси в 45 микролитров 50-миллимолярного гидроксида натрия для лизации при 95 градусах Цельсия в течение пяти минут. Чтобы остановить щелочную реакцию лизиса, добавьте пять микролитров одного молярного раствора гидрохлорида Tris в систему лизиса.
Возьмите один микролитр продукта лизиса в качестве матрицы ПЦР для амплификации целевого фрагмента гена. После ПЦР и секвенирования сравните результаты секвенирования с последовательностью дикого типа, чтобы оценить, расщепляет ли система CRISPR/Cas9 ген-мишень in vivo. Оставьте остальные яйца для последующего развития, так как инделы обнаруживаются на эмбриональной стадии.
После развития, переноса и культивирования вылупившихся нимф в клетку для выращивания, как описано в рукописи. Когда нимфы разовьются до пятой возрастной стадии, разделите их пластиковыми культуральными стаканчиками. Проводите скрещивание с использованием мутантов G0 и саранчи дикого типа.
После сбора оассистов используйте от трех до шести развитых яйцеклеток в каждом оассисте для обнаружения мутаций, как описано ранее. Сохраняйте мутационные положительные оассисты для последующего развития и откажитесь от мутационных отрицательных оассистов. Для криоконсервации вымойте яйца стерильной водой и инкубируйте их в чашке для культивирования, как описано ранее.
Через пять-шесть дней соберите яйца вместе в посуду для культуры и накройте их фрагментами фильтровальной бумаги. Затем оберните всю культуральную посуду парафиновой пленкой. Поставьте блюдо при температуре 25 градусов по Цельсию на два дня, а затем еще два дня при более низкой температуре от 13 до 16 градусов по Цельсию.
Затем переложите блюдо в холодильник с температурой шесть градусов по Цельсию. Добавляйте воду в блюдо каждые две недели, чтобы обеспечить влажную среду для яиц. Наконец, для реанимации криоконсервированных яиц поместите чашку Петри при температуре 25 градусов Цельсия на два дня.
Позже поместите яйца в инкубатор с температурой 30 градусов по Цельсию, пока нимфы не вылупятся. В этом исследовании целевой сайт для системы CRISPR/Cas9 был расположен в первом экзоне. В анализе расщепления Cas9 рибонуклеобелок CRISPR/Cas9 может переваривать фрагмент ПЦР, содержащий целевой сайт, со скоростью расщепления около 55%Результаты секвенирования для оценки частоты мутаций эмбриональной стадии предполагают эффективное редактирование генома на целевом участке.
Эффективность редактирования привела к тому, что частота вылупления нимф составила 52,73%, а 66,67% взрослых особей G0 были мозаичными мутантами. Здесь показана стратегия прохождения линий мутантов. Избыточные гомозиготные яйца были криоконсервированы для улучшения коэффициента использования гомозигот.
Несмотря на то, что скорость вылупления криоконсервированных яиц была снижена с увеличением времени криоконсервации, корректирующие действия, такие как нанесение фрагментов фильтровальной бумаги и восстановление этих консервированных яиц с градиентом повышения температуры, были полезны для реанимации. Самое главное – постараться ограничить механические повреждения, вызванные микроинъекциями. Эта процедура может быть использована в качестве ориентира для достижения других насекомых.
Часть некоторых деталей, таких как методы сбора яиц, инъекции и урожая, должна быть изменена. Этот метод также может быть полезен для изучения метаморфоз и адаптации насекомых к окружающей среде, а создание гомозиготных мутантов саранчи ускорило исследования в этой области.
