Этот протокол позволяет нам генерировать генетически модифицированных муравьев, чтобы понять функцию генов в общении и поведении в социальной среде. Манипулирование генетической системой эусоциальных насекомых является сложной задачей, так как многие виды не спариваются и не размножаются в лабораторных условиях. Поразительная пластичность фенотипа в полу муравьиной гиперназальной клетки позволяет нам устанавливать CRISPR-опосредованные мутантные линии.
Продемонстрировать процедуру будет Кайли Зибер, аспирант из лаборатории. Поддерживайте колонии H.saltator дикого типа в прозрачных пластиковых коробках в комнате для выращивания муравьев при температуре от 22 до 25 градусов по Цельсию и 12-часовому свету, 12-часовому графику темного освещения. Используйте небольшие ящики для выращивания отдельных рабочих или небольших колоний и средние или большие ящики для выращивания больших колоний.
Чтобы создать гнездовые ящики, используйте штукатурку для изготовления полов. Поскольку мокрая штукатурка высыхает в средних и больших ящиках, вдавите пеноблок в штукатурку на несколько сантиметров глубиной и на несколько сантиметров от задней части коробки, чтобы обозначить более низкую область гнезда. Как только штукатурка высохнет, накройте выделенную область гнезда квадратным куском стекла.
Кормите колонии живыми сверчками два раза в неделю и регулярно наносите воду на пластиковый пол гнездовой коробки с помощью бутылки для мытья. Всякий раз, когда происходит кормление, удаляйте мусор и мертвых особей. Заморозьте все отходы и мертвых муравьев на ночь при температуре минус 30 градусов по Цельсию, прежде чем утилизировать эти материалы как обычный мусор.
Периодически добавляйте щепотку высушенных опилок в колонии, чтобы помочь личинкам, когда они подвергаются окукливанию, и помочь рабочим содержать гнездовой ящик в чистоте. Используйте съемник микропипетки, чтобы вытащить стеклянные микроинъекционные иглы. Убедитесь, что используемое стекло хранилось в свободной от пыли и чистой среде.
Используйте двухэтапный процесс для вытягивания микроинъекционных игл. Для первого шага установите нагрев 575, нить накала на 3, скорость на 35, задержку на 145 и тягу на 75. Для второго шага установите теплоту в 425, нить накала в 0, скорость в 15, задержку в 128 и тягу в 200.
Убедитесь, что полученная игла имеет 2-миллиметровый конус и наконечник 0,5 микрометра. Потянув за иглы, держите их в свободной от пыли и чистой среде до использования. Готовят микроинъекционную смесь казеиновых белков и in-vitro синтезированных малых направляющих РНК.
Держите смесь на льду до тех пор, пока не придет время загружать микроинъекционную иглу. Когда смесь микроинъекций не используется, храните при минус 80 градусах Цельсия. Установите параметры впрыска на давление впрыска 140 гектопаскаль, постоянное давление 70 гектопаскаль и время 0,4 секунды.
Отрегулируйте постоянное давление таким образом, чтобы материал тек только в одном направлении, и регулируйте давление и время инъекции только в том случае, если материал не течет из иглы в эмбрион. Загрузите микроинъекционную иглу двумя микролитрами смеси с помощью наконечников пипетки микрозагрузчика. Делайте это медленно, чтобы убедиться, что в смеси не образуются пузырьки.
Сломайте только кончик иглы по краю ленты, чтобы узкая конус все еще сохранялась. Убедитесь, что игла сломана ровно настолько, чтобы наконечник был открыт, но не настолько, чтобы конус был сломан. Затем прикрепите иглу к микроманипулятору.
Отбирайте эмбрионы для микроинъекции из синцитиальной стадии, когда ядра делятся без цитокинеза. Выровняйте эмбрионы на пластине двусторонней ленты, приклеенной к предметному стеклу микроскопа, убедившись, что они хорошо прикреплены к ленте, чтобы предотвратить движение во время инъекции. Уложите эмбрионы в вертикальной ориентации таким образом, чтобы боковая сторона каждого эмбриона находилась на краю ленты.
Поместите слайд и выровненные эмбрионы на сцену микроскопа на специально отведенном рабочем месте для микроинъекции. Выровняйте иглу с первым эмбрионом, который будет введен с помощью микроманипулятора, и латерально проколите первый эмбрион вдоль его дорсальной или вентральной оси под микроскопом. Вводят микроинъекционную смесь, и ищут незначительное движение эмбриона, свидетельствующее о повышении внутреннего давления из-за введенной жидкости.
Кроме того, следите за образованием небольшой капли, содержащей видимые следы ткани или липида на внешней мембране эмбриона. Аккуратно извлеките иглу из эмбриона и приступайте к следующему эмбриону, отрегулировав положение слайда микроскопа. Повторяйте до тех пор, пока не будут введены все эмбрионы.
После того, как все эмбрионы на слайде были успешно введены, перенесите слайд во влажную коробку на один час, чтобы дать эмбрионам время для восстановления перед удалением с слайда. После инкубации промыть горку этанолом, аккуратно удалить введенные эмбрионы из ленты с помощью полулегких щипцов и перенести их в трубку, заполненную небольшим количеством 70% этанола. Переверните трубку несколько раз.
Используя небольшую и мягкую кисть, перенесите все введенные эмбрионы на 1% агаровые пластины с 2% антимикотическим антибиотиком. Инкубируйте пластины при температуре 25 градусов по Цельсию в течение примерно четырех недель, регулярно проверяя их на вылупление. Как только первый эмбрион вылупится в личинку, верните все эмбрионы и личинки в гнездовой ящик с несколькими молодыми работниками-медсестрами для ухода за детенышами.
Поддерживать колонию по ранее продемонстрированным методам. Этот протокол был использован для успешного выполнения редактирования генома эмбрионов Harpegnathos saltator. Результаты были подтверждены с помощью ПЦР и pGEM клонирования ДНК, извлеченной из введенных эмбрионов, с последующим секвенированием ДНК.
Эффективность соматического мутагенеза с использованием этого протокола достигала примерно 40% самцов мутантов F1, которые были соединены с самками дикого типа для получения гетерозиготных самок F2, которые, если не спаривались, производили самцов F3. Самцы мутантов F3 были соединены с гетерозиготными самками, чтобы произвести F4 гомозиготных самок-мутантов. В результате успешного мутагенеза наблюдалось необычное поведение, которое коррелировало с потерей гена-мишени.
Потеря Орко связана с потерей феромонной чувствительности, неспособностью обнаружить добычу, нарушением плодовитости и блужданием из колонии. При выполнении этого протокола повреждение эмбриона во время инъекции должно быть сведено к минимуму. Это можно сделать, убедившись, что наконечник иглы не открыт слишком широко, и медленно перемещая иглу при инъекции.
Подобные методы могут быть использованы для создания и поддержания трансгенных муравьев, которые предоставят более сложные инструменты для зондирования активности и поведения нейронов. CRISPR-опосредованный нейрогенез был использован у других видов эусоциальных насекомых, таких как медоносные пчелы, клональный муравей-рейдер и огненные муравьи. Генетические модификации облегчат функциональные исследования развития, физиологии и социального поведения у эусоциальных насекомых.
