Репликация вируса HBV в экстрагепатии играет важную роль в патогенезе экстрагепатического синдрома. В настоящее время модели клеточной культуры для начала экстрагепатической инфекции ВГВ ограничены. Мы представляем в пробирке не печеночными инфекциями модель, чтобы помочь определить новые факторы хозяина, которые влияют на репликацию HBV и исследовать HBV связанных заболеваний почек.
По сравнению с традиционными моделями инфекции HBV, мы приняли и спроектировали линию клеток 293T, 293T-NE-3NR, и совместно с hepG2.2.15. Инфекция HBV должна быть выполнена в лаборатории уровня биобезопасности 2 или биобезопасности уровня 3. Следует соблюдать методы лабораторной безопасности для обеспечения безопасности лабораторного персонала, и все исследователи должны быть вакцинированы и обнаружить положительные антитела HBS перед выполнением экспериментов hbV.
Начните с культивирования HepG2.2.15 клеток имея в виду, что клетка supernatant, а также все советы, фляги, пластины и трубки, которые вступают в контакт с HepG2.2.15 должны быть пропитаны в 2%virucide ночь до удаления. Удалите флакон, содержащий клетки HepG2.2.15, из жидкого азота и оттаив его в нежной закрученной водяной бане 37 градусов по Цельсию. Перенесите клетки в 25-сантиметровую квадратную культурную колбу и добавьте четыре миллилитров полной культурной среды.
Культура HepG2.2.15 клеток при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа в увлажненные инкубатор. Изменение среды каждые три дня. Когда он будет готов, соберите супернатант клетки в 50-миллилитровую центрифугу.
Закройте крышку твердо и оберните его парафиновой пленкой. Чтобы удалить фрагменты клеток, фильтруй супернатант HepG2.2.15 с мембраной 0,45 микрометра в новую 50-миллилитровую центрифугу. Затем добавьте 14 миллилитров фильтрованного супернатанта в колонку концентратора вируса и закройте крышку.
Центрифуга колонны в 3200 раз г в течение 35 минут в горизонтальной вращающейся центрифуге и соберите супернатантный концентрат HepG2.2.15 в 1,5 миллилитровую трубку. Запуск в режиме реального времени ПЦР, чтобы убедиться, что концентрация, если HBV ДНК в HepG2.2.15 супернатант концентрат находится в пределах стандартного диапазона кривой. Разбавить концентрат в 20 раз, добавив 10 микролитров до 190 микролитров DMEM в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки.
Наряду с супернатантным концентратом подготовьтесь к отрицательному контролю, положительному контролю и четырем разбавлениям количественной справки. Добавьте 450 микролитров буфера извлечения ДНК HBV в каждый образец и центрифугировать их при температуре 12 000 раз в течение пяти минут при комнатной температуре. Объедините 27 микролитров смеси PCR master и три микролитера фермента полимеразы Taq на образец в трубках ПЦР, размещенных на льду.
Затем добавьте 20 микролитров центробежного образца в каждую трубку. Выполняйте ПЦР в режиме реального времени в соответствии с рукописными указаниями и экспорту значений КТ для получения стандартной кривой. Разделите супернатантный концентрат HepG2.2.15 на алициты и храните его при температуре минус 80 градусов по Цельсию до готовности к использованию.
Подготовье инфекционной среды в соответствии с рукописными указаниями. Затем семя HepG2-NE в двух скважинах, 293T-NE-3NR клеток в двух скважинах, и 293T-NE в одной скважине. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа во влажном инкубаторе в течение 24 часов.
После инкубации, наблюдать клетки и приступить к инфекции, если они здоровы. Добавьте к каждому колодец 500 микролитров инфекционного комплекса и инкубировать клетки еще на 24 часа. Вымойте клетки дважды с 500 микролитров PBS.
Затем добавьте один миллилитр среднего к каждому хорошо. Изменение среды осторожно каждые два дня. На 11-й день аккуратно промыть клетки дважды 500 микролитров PBS и исправить клетки с ледяным метанолом для иммунофлуоресценции.
Семя 100 000 клеток на скважину HepG-NE в две скважины, 293T-NE-3NRs в две скважины, и 293T-NE в одну скважину пластины. Семя 100 000 клеток на колодец HepG2.2.15 в пять мембранных вставок в отдельной шести-хорошо пластины. Инкубировать клетки в течение 24 часов.
После инкубации убедитесь, что клетки все приверженцы и в хорошем состоянии. Отбросьте среду в шести-хорошо пластины и клеточной мембраны вставки. Затем поместите мембранные вставки с HepG2.2.15 в шесть хорошо пластины посеяны с HepG-NE, 293T-NE-3NRs, и 293T-NE.
Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа в увлажненные инкубатор, изменяя средний каждые три-четыре дня. Через 10 дней снимите мембранные вставки, аккуратно промойте клетки с помощью PBS дважды и зафиксните клетки ледяным метанолом для иммунофлюоресценции. Инкубация с первичными антителами HBcAg и DAPI привела к явному окрашиванию при наблюдении с целью 10X на флуоресцентном перевернутом микроскопе.
Ядерная локализация была подтверждена окрашиванием с daPI и NTCP-EGFP выражение было определено с зеленой флуоресценции. Места выражения HBcAg были расположены с красной флуоресценцией. Когда DAPI, NTCP и HBcAg находятся в одной клетке, клетка была успешно заражена HBV.
Группа Циклоспорин А была отрицательным контролем, поскольку она предотвращает попадание HBV в ячейки, блокируя NTCP. HBcAg был обнаружен в 293T-NE-3NRs, но не в 293T-NE клеток, указывающих NTCP не является единственным фактором, необходимым для инфекции ВГВ в 293T. Хорошее состояние клеток и эффективная работа являются ключевыми моментами для получения успешных результатов инфекции.
Нежная стирка и изменение средств массовой информации после заражения также имеет важное значение. В качестве альтернативы, HBV инфекции метод с гепатомы основе HepG2-NE клетки имеет более высокую эффективность инфекции, чем этот метод и подходит для скрининга препарата против ВГВ. Моделирование инфекции HBV в 293T-NE-3NR является полезным комплиментом традиционной клеточной модели из-за негепатического фона этих клеток.
Этот метод будет способствовать изучению инфекции ВГВ в негепатических клетках, а также принимающих факторов, необходимых для печени ВГВ.
