Новый 6-Plex ECL-анализ является первым мультиплексным анализом, проверенным и в настоящее время применяемым в клинических испытаниях для скрининга населения в целом. Он одновременно объединяет шесть анализов аутоантител, подходящих для скрининга диабета 1 типа, целиакии и COVID-19 в большой популяции. По сравнению с текущим стандартным анализом аутоантител, этот метод может более эффективно проверять несколько аутоантител для нескольких аутоиммунных заболеваний одновременно.
Использование этого метода сделает крупномасштабный скрининг более осуществимым и специфичным для заболевания, что приведет к раннему прогнозированию заболеваний для профилактики и более точной диагностике для терапии. Для начала добавьте четыре микролитра биотинилированного gad65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 и проинсулиновый антигенный белок в пробирку, содержащую 156 микролитров 1% BSA, и смешайте с 240 микролитрами соответствующих стрептавидин-конъюгированных линкеров, 1, 2, 3, 8, 9 и 10. Затем инкубировать смесь в течение 30 минут при комнатной температуре.
Aliquot 160 микролитров стоп-раствора в каждую пробирку и инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 30 минут. Теперь возьмите 400 микролитров раствора смеси из каждой трубки и соедините их вместе. Добавьте в смесь четыре микролитра меченого рутением GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 и проинсулинового антигена.
Затем добавляют 1,6 миллилитра стоп-раствора и 3,2 миллилитра PBS. Тщательно перемешайте все компоненты. И теперь раствор антигена готов к использованию в анализе.
Для 96-луночной ПЦР-пластины аликвотьте семь микролитров сыворотки на лунку и накройте пластину герметизирующей пленкой. Затем разогрейте сыворотки при 56 градусах Цельсия в течение 30 минут на аппарате ПЦР и кратковременно центрифугируйте пластину в 100 раз G в течение одной минуты. Добавьте 63 микролитра приготовленного раствора антигена на лунку, смешайте с сыворотками и накройте пластину ПЦР герметизирующей фольгой, чтобы избежать света.
Встряхните пластину на шейкере со скоростью 450 об/мин в течение двух часов при комнатной температуре. А затем высиживать пластину при четырех градусах Цельсия в течение 18-24 часов. Возьмите плиту 6-Plex из холодильника с четырьмя градусами Цельсия, чтобы пластина достигла комнатной температуры.
Затем добавьте 150 микролитров 3%Blocker A к каждой лунке пластины 6-Plex. Накройте пластину фольгой, чтобы избежать света. Положите тарелку обратно в холодильник с температурой четыре градуса Цельсия и высиживайте на ночь.
В конце инкубации, как только тарелка будет извлечена из холодильника, снимите весь буфер с тарелки. Похлопайте тарелку по бумажным полотенцам, чтобы они высохли, и мойте ее трижды 150 микролитрами стирального буфера на каждую лунку каждый раз. Высушите пластину на бумажном полотенце и аликвотьте 30 микролитров сывороточного антигена, инкубируемого из каждой лунки ночной инкубирующей ПЦР-пластины в две лунки 6-Plex пластины.
Накройте тарелку фольгой, затем положите пластину на шейкер и встряхните со скоростью 450 об/мин при комнатной температуре в течение одного часа. Сбросьте раствор, присутствующий в пластине 6-Plex, и промыть пластину три раза 150 микролитрами промывочного буфера 0,4 М хлорида натрия на скважину. После завершения третьей стирки высушите пластину на бумажном полотенце и добавьте в каждую лунку по 150 микролитров считывающего буфера.
Уровни шести аутоантител для GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA и COVID-19A из анализа 6-Plex ECL были хорошо коррелированы с их соответствующими шестью одиночными анализами ECL и текущим стандартным радиосвязывающим анализом. Значения индекса для каждой выборки для всех шести антител были рассчитаны по соответствующим положительным и отрицательным контрольным показателям. Наблюдалось значение индекса, превышающее значение отсечения, что указывало на положительный результат.
Аутоантитела в сыворотке крови нарушили меченый рутением антиген к биотинилированному антигену, образовав комплекс со специфическим линкером для построения мультиплексирующей платформы. Эта тактика делает крупномасштабный скрининг более осуществимым и более эффективным среди населения в целом на диабет первого типа и сопутствующие заболевания, что приводит к раннему прогнозированию и профилактике заболеваний.
