Этот протокол может определить, препятствуют ли кишки и щитовидная железа распространению вируса, и может помочь в оценке риска вирусов, переносимых комарами, передаваемых Aedes aegypti. Наш протокол включал два метода инфекции: пероральное кормление и внутригрудную инъекцию, которые могли эффективно оценить векторную компетентность арбовируса. Этот протокол может быть применен к дополнительным арбовирусным инфекциям у различных комаров-переносчиков, таких как вирус денге и вирус Зика в Аэдесе, и может оказаться практически осуществимой процедурой.
Продемонстрировать процедуру будет Фэй Ван, научный сотрудник моей лаборатории. Чтобы выполнить искусственное кормление с использованием системы искусственного кормления комаров, обрежьте коллагеновые мембраны до соответствующего размера и закрепите их на резервуарах с помощью уплотнительных колец. Добавьте в резервуары три миллилитра смеси вируса и крови и загерметизируйте резервуары пластиковыми пробками для предотвращения утечек.
Положите пластиковые стаканчики с комарами в бардачок. Вкрутите герметичные резервуары в кормушку FU1 и поставьте один резервуар на одну чашку. Включите блок питания, и кормите комаров в течение одного часа.
После кормления обезболивайте комаров льдом в течение нескольких секунд, пока они не упадут в обморок. Вылейте обезболиваемых комаров в чашку Петри, помещенную на лед, и быстро накройте крышкой. Соберите набухших самок комаров щипцами и переложите их в новые пластиковые стаканчики по 50 самок комаров на чашку.
Оберните чашку разрезанной сеткой от москитной сетки, и накройте ее крышкой с отверстием посередине. Нарежьте губку небольшими кусочками и выложите их на чашки. Добавьте 8% раствор глюкозы на губку с помощью пластиковой одноразовой пипетки.
Поместите чашки с самками комаров в инкубатор при температуре 27 градусов Цельсия при влажности 80% на 10 дней. Заменяйте новую губку, насыщенную глюкозой, каждые 72 часа. Для внутригрудной инокуляции подготовьте самок комаров, как описано в текстовой рукописи.
Чтобы приготовить разбавление инфекционного вируса, достаньте вирусный бульон из морозильной камеры при температуре 80 градусов Цельсия и разморозьте его на льду. Разбавляют вирусный запас в 100-нанолитровом разведении вируса, содержащего от 100 до 500 бляшечных единиц вируса, средой RPMI 1640, содержащей 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина. Поместите разведение вируса на лед.
Затем подготовьте иглы для микроинъекций с помощью Puller 1000 с параметрами в программе съёмника игл, установленными как индекс тепла 450, усилие в g до 110, расстояние в миллиметре до единицы и задержка в секундах до нуля. Отрежьте кончик вытащенной иглы пинцетом под препарирующим микроскопом при 16-кратном увеличении. Залейте иглу минеральным маслом через одноразовый стерильный шприц.
Вставьте иглу в инжектор, следуя инструкциям на машине. Осторожно вставьте иглу в трубку, содержащую разведение инфекционного вируса. Затем нажмите кнопку «Заполнить», чтобы залить в иглу примерно четыре микролитра разбавления вируса.
После заполнения иглы не прикасайтесь к игле и не повреждайте ее. Соберите пинцетом примерно 50 самок анестезированных комаров и положите их на тарелку со льдом. Поместите пластину под инъектор, а иглу вставьте в грудную полость комара под препарирующим микроскопом.
Установите объем впрыска на 100 нанолитров и скорость на 50 нанолитров в секунду. Нажмите кнопку «Впрыскать», чтобы раствор вируса попал в комара. При успешной инъекции живот слегка выпячивается.
Положите зараженного комара в новый пластиковый стаканчик, поставленный на лед. Когда количество зараженных комаров станет достаточным, оберните чашку разрезанной сеткой от москитов и накройте крышкой. Чтобы собрать слюну зараженных самок комаров, вылейте анестезированных комаров в чашку Петри, помещенную на лед, и быстро закройте крышку.
Положите наконечники пипеток объемом 10 микролитров, наполненные иммерсионным маслом, рядом на резиновую грязь. Соберите самок комаров пинцетом и положите их на тарелку со льдом. Удалите им ножки и крылышки пинцетом.
Поместите ротовой аппарат одного комара на каждый наконечник пипетки, чтобы собрать слюну, выделяемую комарами в масло при комнатной температуре. Через 45-60 минут поместите наконечники пипеток в 1,5-миллилитровые пробирки, содержащие 200 микролитров среды для разбавления вируса. Центрифугируйте пробирки при 5 000 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, чтобы вытеснить слюну в пробирки.
Храните слюносодержащие трубки при температуре 80 градусов Цельсия для последующего определения скорости передачи. После сбора слюны препарируйте зараженных самок комаров. С помощью пинцета отрежьте головы комаров и поместите каждую голову в отдельную трубку, содержащую 200 микролитров среды RPMI 1640.
Захватите грудную клетку пинцетом. Затем захватите предпоследний сегмент живота другим пинцетом и вытащите кишку. Очистите кишечник от любых бродячих тканей и органов.
Промойте кишечник PBS и поместите каждую кишку в отдельную пробирку, содержащую 200 микролитров среды RPMI 1640. Храните эти пробирки при температуре 80 градусов Цельсия для последующего определения распространения вируса и скорости заражения. В этом репрезентативном анализе были определены вирусные РНК в кишечнике, голове и слюне самок комаров через 10 дней после заражения.
Титр вируса озера Эбинур в кишечнике, головах и слюне внутригрудно инокулированных комаров был выше, чем у комаров, инфицированных орально. Коэффициент инфицирования и распространения для внутригрудных инокулированных комаров составил 100%, а для комаров, инфицированных орально, - 70% и 38,1% соответственно. Скорость передачи для внутригрудно инокулированных комаров достигала 90%, но для комаров, инфицированных орально, составляла только 4,8%Набухшие самки комаров были отобраны для поддержания консистенции, так как количество корма влияет на содержание вируса.
