Dieses Protokoll kann feststellen, ob der Darm und die Schilddrüsen die Ausbreitung des Virus verhindern, und kann bei der Risikobewertung von durch Mücken übertragenen Viren helfen, die von Aedes aegypti übertragen werden. Unser Protokoll umfasste zwei Infektionsmethoden, die orale Ernährung und die intrathorakale Injektion, die die Vektorkompetenz des Arbovirus effektiv beurteilen konnten. Dieses Protokoll könnte auf zusätzliche Arbovirusinfektionen in einer Vielzahl von Mückenvektoren, wie z. B. Dengue-Virus und Zika-Virusinfektion in Aedes, angewendet werden und könnte sich als praktikables Verfahren erweisen.
Fei Wang, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, demonstriert das Verfahren. Um eine künstliche Ernährung mit dem künstlichen Mückenfütterungssystem durchzuführen, schneiden Sie die Kollagenmembranen auf die entsprechende Größe zu und befestigen Sie sie mit den O-Ringen an den Reservoirs. Geben Sie drei Milliliter des Virus-Blut-Gemisches in die Reservoirs und verschließen Sie die Reservoirs mit Plastikstopfen, um Leckagen zu vermeiden.
Legen Sie die Plastikbecher mit Mücken in das Handschuhfach. Schrauben Sie die versiegelten Behälter in den FU1-Feeder und stellen Sie einen Behälter auf eine Tasse. Schalten Sie das Netzteil ein und füttern Sie die Mücken eine Stunde lang.
Betäuben Sie die Mücken nach dem Füttern einige Sekunden lang mit Eis, bis sie ohnmächtig werden. Gießen Sie die betäubten Mücken in eine auf Eis gestellte Petrischale und decken Sie den Deckel schnell ab. Pflücken Sie angeschwollene weibliche Mücken mit einer Pinzette und übertragen Sie sie in neue Plastikbecher mit 50 weiblichen Mücken pro Becher.
Wickeln Sie den Becher mit einem abgeschnittenen Moskitonetz ein und decken Sie ihn mit einem Deckel mit einem Loch in der Mitte ab. Schneiden Sie den Biskuit in kleine Stücke und legen Sie sie auf die Tassen. Geben Sie 8%ige Glukoselösung mit einer Einwegpipette aus Kunststoff auf den Schwamm.
Stellen Sie die Becher mit weiblichen Mücken 10 Tage lang bei 27 Grad Celsius und 80 % Luftfeuchtigkeit in den Inkubator. Ersetzen Sie alle 72 Stunden einen neuen glukosegesättigten Schwamm. Für die intrathorakale Inokulation bereiten Sie weibliche Stechmücken wie im Textmanuskript beschrieben vor.
Um die infektiöse Virusverdünnung vorzubereiten, nehmen Sie den Virusbestand aus dem 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank und tauen Sie ihn auf Eis auf. Verdünnen Sie den Virusbestand bei einer 100-Nanoliter-Virusverdünnung, die 100 bis 500 plaquebildende Einheiten des Virus enthält, mit RPMI 1640-Medium, das 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin enthält. Legen Sie die Virusverdünnung auf Eis.
Als nächstes bereiten Sie die Mikroinjektionsnadeln mit einem Puller 1000 vor, wobei die Parameter im Nadelzieherprogramm als Hitzeindex auf 450, Kraft in g auf 110, Abstand in Millimeter auf eins und Verzögerung in Sekunden auf Null eingestellt sind. Schneiden Sie die Spitze einer gezogenen Nadel mit einer Pinzette unter einem Präpariermikroskop bei 16-facher Vergrößerung ab. Füllen Sie die Nadel mit Mineralöl über eine sterile Einwegspritze auf.
Setzen Sie die Nadel gemäß den Anweisungen auf der Maschine in den Injektor ein. Führen Sie die Nadel vorsichtig in ein Röhrchen ein, das eine infektiöse Virusverdünnung enthält. Drücken Sie dann die Fülltaste, um etwa vier Mikroliter Virusverdünnung in die Nadel zu füllen.
Sobald die Nadel gefüllt ist, berühren oder beschädigen Sie die Nadel nicht. Nehmen Sie etwa 50 weibliche betäubte Mücken mit einer Pinzette und legen Sie sie auf einen Eisteller. Legen Sie die Platte unter den Injektor und führen Sie die Nadel unter einem Seziermikroskop in die Brusthöhle der Mücke ein.
Stellen Sie das Einspritzvolumen auf 100 Nanoliter und die Rate auf 50 Nanoliter pro Sekunde ein. Drücken Sie die Injizieren-Taste, um die Viruslösung in die Mücke fließen zu lassen. Nach erfolgreicher Injektion wölbt sich der Bauch leicht.
Geben Sie die infizierte Mücke in einen neuen Plastikbecher, der auf Eis gestellt wird. Wenn die Anzahl der infizierten Mücken ausreicht, wickeln Sie den Becher mit einem geschnittenen Moskitonetznetz ein und decken Sie ihn mit dem Deckel ab. Um Speichel von den infizierten weiblichen Mücken zu sammeln, gießen Sie die betäubten Mücken in eine auf Eis gestellte Petrischale und schließen Sie den Deckel schnell.
Legen Sie die mit Immersionsöl gefüllten 10-Mikroliter-Pipettenspitzen nebeneinander auf den Gummischlamm. Pflücken Sie die weiblichen Mücken mit einer Pinzette und legen Sie sie auf einen Eisteller. Entfernen Sie ihre Beine und Flügel mit einer Pinzette.
Setzen Sie das Mundwerkzeug einer Mücke auf jede Pipettenspitze, um den Speichel zu sammeln, der von den Mücken bei Raumtemperatur in das Öl abgesondert wird. Legen Sie die Pipettenspitzen nach 45 bis 60 Minuten in 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 200 Mikrolitern Virenverdünnungsmedium. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 5.000 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um Speichel in die Röhrchen auszustoßen.
Lagern Sie die speichelhaltigen Röhrchen bei 80 Grad Celsius zur anschließenden Bestimmung der Übertragungsraten. Sezieren Sie nach der Speichelentnahme die infizierten weiblichen Mücken. Schneiden Sie mit einer Pinzette die Köpfe der Mücken ab und legen Sie jeden Kopf in ein einzelnes Röhrchen mit 200 Mikrolitern RPMI 1640 Medium.
Fassen Sie den Brustkorb mit einer Pinzette. Fassen Sie dann das vorletzte Segment des Bauches mit einer anderen Pinzette und ziehen Sie den Darm heraus. Reinigen Sie den Darm von verirrtem Gewebe und Organen.
Waschen Sie den Darm mit PBS und geben Sie jeden Darm in ein einzelnes Röhrchen mit 200 Mikrolitern RPMI 1640 Medium. Lagern Sie diese Röhrchen bei 80 Grad Celsius zur anschließenden Bestimmung der Virusausbreitung und Infektionsrate. In dieser repräsentativen Analyse wurden virale RNAs im Darm, Kopf und Speichel der weiblichen Stechmücken 10 Tage nach der Infektion bestimmt.
Der Virustiter des Ebinur-Lake-Virus in den Eingeweiden, Köpfen und im Speichel der intrathorakal geimpften Mücken war höher als der der oral infizierten Mücken. Die Infektions- und Ausbreitungsrate für die intrathorakal inokulierten Mücken betrug 100 % und für die oral infizierten Mücken 70 % bzw. 38,1 %. Die Übertragungsrate für die intrathorakal geimpften Mücken erreichte bis zu 90 %, aber für die oral infizierten Mücken betrug sie nur 4,8 %Die angeschwollenen weiblichen Mücken wurden ausgewählt, um die Konsistenz zu erhalten, da die Futtermenge den Virusgehalt beeinflusst.
