Esse protocolo pode determinar se o intestino e as glândulas tireoides impedem a disseminação viral e pode auxiliar nas avaliações de risco de vírus transmitidos por mosquitos transmitidos pelo Aedes aegypti. Nosso protocolo incluiu dois métodos de infecção, a alimentação por via oral e a injeção intratorácica, que puderam avaliar efetivamente a competência vetorial das arboviroses. Este protocolo pode ser aplicado a infecções adicionais por arbovírus em uma variedade de mosquitos vetores, como a infecção pelo vírus da dengue e pelo vírus Zika no Aedes, e pode ser um procedimento viável.
Quem demonstrará o procedimento será Fei Wang, assistente de pesquisa do meu laboratório. Para realizar a alimentação artificial usando o sistema de alimentação artificial do mosquito, corte as membranas de colágeno no tamanho adequado e fixe-as aos reservatórios com os anéis O. Adicione três mililitros da mistura vírus-sangue aos reservatórios e sele os reservatórios usando tampões plásticos para evitar vazamentos.
Coloque os copos plásticos contendo mosquitos no porta-luvas. Rosqueie os reservatórios selados no alimentador FU1 e coloque um reservatório em um copo. Ligue a unidade de energia e alimente os mosquitos por uma hora.
Após a alimentação, anestesiar os mosquitos com gelo por vários segundos até que desmaiem. Despeje os mosquitos anestesiados em uma placa de Petri colocada no gelo e cubra a tampa rapidamente. Pegue mosquitos fêmeas ingurgitados com fórceps e transfira-os para novos copos plásticos a 50 mosquitos fêmeas por xícara.
Embrulhe o copo com uma malha mosquiteira cortada e cubra com uma tampa com um buraco no meio. Corte a esponja em pedaços pequenos e coloque-os sobre as xícaras. Adicione solução de glicose a 8% na esponja usando um conta-gotas descartável de plástico.
Coloque os copos contendo fêmeas de mosquitos na incubadora a 27 graus Celsius a 80% de umidade por 10 dias. Substitua uma nova esponja saturada de glicose a cada 72 horas. Para a inoculação intratorácica, preparar fêmeas de mosquitos conforme descrito no manuscrito do texto.
Para preparar a diluição do vírus infeccioso, remova o estoque de vírus do freezer de 80 graus Celsius e descongele-os no gelo. Diluir o estoque de vírus em uma diluição de vírus de 100 nanolitros contendo 100 a 500 unidades formadoras de placas de vírus com meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina. Coloque a diluição do vírus no gelo.
Em seguida, prepare as agulhas de microinjeção usando um extrator 1000 com os parâmetros no programa extrator da agulha definidos como índice de calor para 450, força em g para 110, distância em milímetro para um, e atraso em segundos para zero. Cortar a ponta de uma agulha puxada com uma pinça sob um microscópio dissecante em aumento de 16x. Encha novamente a agulha com óleo mineral através de uma seringa estéril descartável.
Conecte a agulha no injetor seguindo as instruções da máquina. Introduza cuidadosamente a agulha num tubo contendo uma diluição de vírus infeccioso. Em seguida, pressione o botão Fill para encher aproximadamente quatro microlitros de diluição de vírus na agulha.
Uma vez que a agulha esteja cheia, não toque ou danifique a agulha. Pegue aproximadamente 50 fêmeas de mosquitos anestesiados com pinças e coloque-os em uma placa de gelo. Coloque a placa sob o injetor e insira a agulha na cavidade torácica do mosquito sob um microscópio dissecante.
Ajuste o volume de injeção para 100 nanolitros e a taxa para 50 nanolitros por segundo. Pressione o botão Injetar para deixar a solução do vírus fluir para o mosquito. Após a injeção bem-sucedida, o abdômen se projeta ligeiramente.
Coloque o mosquito infectado em um novo copo plástico colocado no gelo. Quando o número de mosquitos infectados for suficiente, envolva o copo com uma malha mosquiteira cortada e cubra-o com a tampa. Para coletar saliva dos mosquitos fêmeas infectados, despeje os mosquitos anestesiados em uma placa de Petri colocada no gelo e feche a tampa rapidamente.
Coloque as pontas da pipeta de 10 microlitros cheias de óleo de imersão lado a lado sobre a lama de borracha. Pegue as fêmeas de mosquitos com uma pinça e coloque-as em uma placa de gelo. Retire as pernas e asas com uma pinça.
Coloque a parte bucal de um mosquito em cada ponta da pipeta para coletar a saliva conforme secretada no óleo pelos mosquitos em temperatura ambiente. Após 45 a 60 minutos, coloque as pontas da pipeta em tubos de 1,5 mililitro contendo 200 microlitros de meio diluente viral. Centrifugar os tubos a 5.000 g durante cinco minutos a quatro graus Celsius para expelir saliva para os tubos.
Armazenar os tubos contendo saliva a 80 graus Celsius para posterior determinação das taxas de transmissão. Após a coleta de saliva, dissecar as fêmeas de mosquitos infectadas. Usando pinças, corte as cabeças dos mosquitos e coloque cada cabeça em um tubo individual contendo 200 microlitros de meio RPMI 1640.
Pegue o tórax com um tweezer. Em seguida, pegue o penúltimo segmento do abdômen com outro tweezer e puxe o intestino para fora. Limpe o intestino para qualquer tecido e órgãos perdidos.
Lave o intestino com PBS e coloque cada intestino em um tubo individual contendo 200 microlitros de meio RPMI 1640. Armazenar estes tubos a 80 graus Celsius para posterior determinação da disseminação do vírus e taxa de infecção. Nesta análise representativa, RNAs virais no intestino, cabeça e saliva das fêmeas de mosquitos aos 10 dias pós-infecção foram determinados.
O título viral do vírus Ebinur Lake no intestino, cabeça e saliva dos mosquitos inoculados intratoracicamente foi maior do que nos mosquitos infectados oralmente. A taxa de infecção e disseminação para os mosquitos inoculados intratoracicamente foi de 100% e para os mosquitos infectados por via oral foi de 70% e 38,1%, respectivamente. A taxa de transmissão para os mosquitos inoculados intratoracicamente atingiu até 90%, mas para os mosquitos infectados por via oral foi de apenas 4,8%As fêmeas ingurgitadas foram colhidas para manter a consistência, pois a quantidade de alimentação afeta o conteúdo viral.
