Ce protocole peut déterminer si les intestins et les glandes thyroïdes entravent la propagation virale et peut aider à évaluer les risques de virus transmis par les moustiques transmis par Aedes aegypti. Notre protocole comprenait deux méthodes d’infection, l’alimentation orale et l’injection intrathoracique, qui pouvaient évaluer efficacement la compétence vectorielle de l’arbovirus. Ce protocole pourrait être appliqué à d’autres infections à arbovirus chez divers moustiques vecteurs, tels que le virus de la dengue et l’infection par le virus Zika chez Aedes, et pourrait s’avérer une procédure réalisable.
La démonstration de la procédure sera Fei Wang, un assistant de recherche de mon laboratoire. Pour effectuer une alimentation artificielle à l’aide du système d’alimentation artificiel contre les moustiques, coupez les membranes de collagène à la taille appropriée et fixez-les aux réservoirs avec les joints toriques. Ajoutez trois millilitres du mélange virus-sang dans les réservoirs et scellez les réservoirs à l’aide de bouchons en plastique pour éviter les fuites.
Mettez les gobelets en plastique contenant des moustiques dans la boîte à gants. Vissez les réservoirs scellés dans le chargeur FU1 et placez un réservoir sur une tasse. Allumez l’unité d’alimentation et nourrissez les moustiques pendant une heure.
Après s’être nourris, anesthésiez les moustiques avec de la glace pendant plusieurs secondes jusqu’à ce qu’ils s’évanouissent. Versez les moustiques anesthésiés dans une boîte de Petri placée sur de la glace et couvrez rapidement le couvercle. Choisissez des moustiques femelles engorgées avec des forceps et transférez-les dans de nouveaux gobelets en plastique à 50 moustiques femelles par tasse.
Enveloppez la tasse avec un filet de moustiquaire coupé et couvrez-la d’un couvercle percé d’un trou au milieu. Coupez l’éponge en petits morceaux et mettez-les sur les tasses. Ajouter la solution de glucose à 8% sur l’éponge à l’aide d’un compte-gouttes jetable en plastique.
Placez les tasses contenant des moustiques femelles dans l’incubateur à 27 degrés Celsius à 80% d’humidité pendant 10 jours. Remplacez une nouvelle éponge saturée en glucose toutes les 72 heures. Pour l’inoculation intrathoracique, préparer les moustiques femelles comme décrit dans le manuscrit.
Pour préparer la dilution du virus infectieux, retirez le stock de virus du congélateur à 80 degrés Celsius et décongelez-le sur de la glace. Diluer le stock de virus à une dilution virale de 100 nanolitres contenant 100 à 500 unités formant des plaques virales avec un milieu RPMI 1640 contenant 10% FBS et 1% pénicilline-streptomycine. Placer la dilution du virus sur de la glace.
Ensuite, préparez les aiguilles de micro-injection à l’aide d’un Puller 1000 avec les paramètres du programme d’extraction d’aiguilles réglés comme indice de chaleur à 450, force en g à 110, distance en millimètre à un et retard en secondes à zéro. Couper la pointe d’une aiguille tirée avec une pince à épiler au microscope à dissection à un grossissement de 16x. Remplissez l’aiguille avec de l’huile minérale à l’aide d’une seringue stérile jetable.
Fixez l’aiguille dans l’injecteur en suivant les instructions de la machine. Insérez soigneusement l’aiguille dans un tube contenant une dilution virale infectieuse. Ensuite, appuyez sur le bouton Fill pour remplir environ quatre microlitres de dilution virale dans l’aiguille.
Une fois l’aiguille remplie, ne touchez pas et n’endommagez pas l’aiguille. Choisissez environ 50 moustiques anesthésiés femelles avec une pince à épiler et placez-les sur une plaque de glace. Placez la plaque sous l’injecteur et insérez l’aiguille dans la cavité thoracique du moustique sous un microscope à dissection.
Réglez le volume d’injection sur 100 nanolitres et le débit sur 50 nanolitres par seconde. Appuyez sur le bouton Injecter pour laisser la solution virale s’écouler dans le moustique. En cas d’injection réussie, l’abdomen se gonfle légèrement.
Mettez le moustique infecté dans un nouveau gobelet en plastique placé sur de la glace. Lorsque le nombre de moustiques infectés est suffisant, enveloppez la tasse avec un filet de moustiquaire coupé et couvrez-le avec le couvercle. Pour recueillir la salive des moustiques femelles infectées, versez les moustiques anesthésiés dans une boîte de Petri placée sur de la glace et fermez le couvercle rapidement.
Placez côte à côte des embouts de pipette de 10 microlitres remplis d’huile d’immersion sur la boue de caoutchouc. Choisissez les moustiques femelles avec une pince à épiler et placez-les sur une plaque de glace. Enlevez leurs pattes et leurs ailes avec une pince à épiler.
Placez la partie buccale d’un moustique sur chaque pointe de pipette pour recueillir la salive sécrétée dans l’huile par les moustiques à température ambiante. Après 45 à 60 minutes, placez les embouts des pipettes dans des tubes de 1,5 millilitre contenant 200 microlitres de milieu diluant pour virus. Centrifuger les tubes à 5 000 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour expulser la salive dans les tubes.
Entreposer les tubes contenant de la salive à 80 degrés Celsius pour déterminer ensuite les taux de transmission. Après la collecte de salive, disséquez les moustiques femelles infectées. À l’aide d’une pince à épiler, coupez la tête des moustiques et placez chaque tête dans un tube individuel contenant 200 microlitres de milieu RPMI 1640.
Saisissez le thorax avec une pince à épiler. Ensuite, saisissez l’avant-dernier segment de l’abdomen avec une autre pince à épiler et retirez l’intestin. Nettoyez l’intestin pour tout tissu et organe errant.
Lavez l’intestin avec du PBS et placez chaque intestin dans un tube individuel contenant 200 microlitres de milieu RPMI 1640. Conservez ces tubes à 80 degrés Celsius pour déterminer ensuite la dissémination du virus et le taux d’infection. Dans cette analyse représentative, les ARN viraux dans l’intestin, la tête et la salive des moustiques femelles 10 jours après l’infection ont été déterminés.
Le titre du virus du lac Ebinur dans les intestins, la tête et la salive des moustiques inoculés par voie intrathoracique était plus élevé que celui des moustiques infectés par voie orale. Le taux d’infection et de dissémination des moustiques inoculés par voie intrathoracique était de 100 % et de 70 % et 38,1 % respectivement pour les moustiques infectés par voie orale. Le taux de transmission des moustiques inoculés par voie intrathoracique a atteint jusqu’à 90%, mais pour les moustiques infectés par voie orale, il n’était que de 4,8%Les moustiques femelles engorgées ont été cueillies pour maintenir la consistance, car la quantité d’alimentation affecte le contenu viral.
