Этот протокол продемонстрировал стандартизированный метод построения трехмерных опухолей сфероидов. И эта методология обеспечила высокую схему и высокий контент-анализ 3D-опухолевых конструкций. Используя стандартный метод построения опухолевого сфероида и высокопроизводительную систему визуализации и анализа, эффективность и точность тестов на лекарственные средства, сформированные на трехмерных сфероидах, могут быть значительно увеличены.
В этом протоколе мы использовали AMG510 для лечения сфероида NCI-H23 в качестве примера. В ходе эксперимента мы смогли наблюдать значительное влияние ракового таргетного препарата на опухолевые сфероиды. Для начала налейте пипеткой 100 микролитров антиадгезионного реагента в каждую лунку 48-луночной пластины с U-образным дном лунки и держите 10 минут.
Через 10 минут аспирируйте реагент для покрытия и дважды промойте стерилизованным PBS. Поместите культуральную тарелку в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненном воздухе с 5% углекислым газом до использования. Наблюдайте за клетками под микроскопом.
Затем дважды промойте клетки, культивируемые в колбе T25, с помощью PBS, чтобы удалить питательную среду, и обработайте расширенные клетки одним миллилитром 0,25% трипсина ЭДТА в течение одной-двух минут в инкубаторе при температуре 37 градусов по Цельсию, 5% углекислого газа. Подтвердите форму клетки под микроскопом. А затем прекратить лечение трипсином, аспирировав использованную суспензию трипсина ЭДТА в колбу Т25 и промыв клетки четырьмя миллилитрами свежей среды.
Перенесите всю суспензию в 15-миллилитровую пробирку и используйте один миллилитр свежей среды, чтобы смыть остаточные ячейки и добавить ее в пробирку. Центрифугируйте клетки при 186,48 G в течение пяти минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте 10 миллилитров свежей среды в гранулу клетки и аккуратно пипеткой, пока клетки не окажутся в однородной суспензии.
Аспирируйте 0,1 миллилитра клеточной суспензии в новую центрифужную пробирку. Добавьте 0,9 миллилитра свежей среды, а затем хорошо пипетируйте суспензию. Извлеките 10 микролитров клеточной суспензии для подсчета клеток.
Повторите этот процесс один или два раза и возьмите среднее значение. Разбавьте суспензию, чтобы достичь конечной плотности посева 50 000 клеток на миллилитр. Затем добавьте 200 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку 48-луночной U-образной нижней пластины.
Оберните уплотнительную пленку вокруг пластины и центрифугируйте ее при 119,35 G в течение пяти минут при комнатной температуре. После центрифугирования снимите защитную пленку и добавьте пять-восемь миллилитров стерилизованной воды в водный канал, окружающий колодцы. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов по Цельсию в течение пяти дней.
Не меняйте и не добавляйте воду в водный канал в течение этого периода и наблюдайте за агрегацией клеток в течение следующих пяти дней. Для встраивания геля, вынув замороженный гель из холодильника при температуре минус 20 градусов по Цельсию, поместите его на ящик со льдом на все время эксперимента. Наблюдайте за клеточными сфероидами под микроскопом.
Перед началом заделки геля следует еще раз проверить состояние сфероидов. Осторожно удалите 150 микролитров среды и вставьте каждый сфероид в гель, медленно добавляя жидкий гель со стенки лунки, перемещая предварительно охлажденный наконечник пипетки вокруг и внутри лунки. Подождите пять минут и, если гель не распределяется равномерно, аккуратно нанесите гель наконечником пипетки объемом 10 микролитров.
Каждая лунка содержит опухолевый сфероид, 25 микролитров 3,5 миллиграмма на миллилитр геля и 50 микролитров полной питательной среды. Также добавьте 75 микролитров среды в контрольные приборы. Инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут до полного завершения гидрогелеобразования.
Подтвердите статус гелеобразования под микроскопом. Наложите 125 микролитров свежей среды на каждый образец и культивируйте сфероиды еще 7-10 дней. Подготовьте группы сфероидов по четыре-шесть лунок в каждой и выберите для анализа не менее трех из них.
Растворите препарат согласно инструкции производителя и приготовьте 100-кратные рабочие растворы с ДМСО. Используйте 0,1% ДМСО в качестве положительного контроля и добавьте 125 микролитров обработанной лекарственным препаратом среды в каждую лунку. Поместите тарелку обратно в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненном воздухе с 5% углекислого газа.
На этом этапе каждая лунка содержит опухолевый сфероид, 25 микролитров 3,5 миллиграмма на миллилитр геля и 175 микролитров среды. Контрольные содержат 200 микролитров среды. Измерьте жизнеспособность сфероида с помощью набора для анализа alamarBlue в соответствии с рекомендациями производителя.
Аспирируйте 100 микролитров надосадочной среды из каждой лунки в новую тестовую пластину. Затем измерьте жизнеспособность с помощью микропланшетного фотометра. Измерьте его в первый, четвертый, седьмой и 10-й день после встраивания сфероидов в гель.
Добавьте по 80 микролитров свежей среды в каждую лунку культуральной тарелки. Затем замените еще 100 микролитров обработанной препаратом среды. Убедитесь, что в колодце нет остатков alamarBlue.
Аспирируйте 100 микролитров среды перед визуализацией и поместите пластину на сцену. Получение цифровых изображений сфероидов осуществляется с помощью автоматизированного микроскопа с десятикратным объективом. Микроскоп может автоматически фокусировать и централизовать эти сфероиды.
Дождитесь автоматической визуализации. Для каждого сфероида приобретается четыре изображения. Интегрированное изображение формируется и обрабатывается с помощью программного обеспечения, подключенного к системе визуализации с высоким содержанием.
Нажмите кнопку «Процесс исправления изображения» и выберите интегрированные образы в программном обеспечении. Выберите модель U net и введите коэффициент конверсии. Нажмите в нижней части экрана, чтобы начать обработку изображения.
Сохраняйте данные о диаметре, периметре и шероховатости в программном обеспечении для работы с электронными таблицами. Наконец, добавьте 100 микролитров свежей среды с препаратом и поместите пластину обратно в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненном воздухе с 5% углекислым газом. На этом рисунке показаны изображения светлого поля сфероидов клеток NCI-H23, обработанных различными концентрациями AMG510 и автоматически захваченных микроскопом с высоким содержанием.
Столбцы представляют разные дни, а строки представляют разные концентрации наркотиков. Результаты включают три сфероида для каждого состояния. Жизнеспособность опухолевого сфероида в группах образцов, обработанных AMG510, измеряли на первый, четвертый, седьмой и 10-й день.
Жизнеспособность концевых клеток образцов с градиентами концентрации показана на этом рисунке. Диаметры опухолевых сфероидов измеряли на первый, четвертый, седьмой и 10-й день. Коэффициент роста сфероида определяли как конечный объем по отношению к исходному объему и рассчитывали с использованием диаметров сфероидов.
Коэффициент торможения роста сфероида определяли относительно объема и рассчитывали с использованием диаметров сфероидов. Шероховатость опухоли измерялась программным обеспечением на первый, четвертый, седьмой и 10-й день, что указывает на инвазивность опухолевых сфероидов. Периметр сфероида был обнаружен и нарисован программным обеспечением с использованием алгоритмов глубокого обучения.
Затем сфероидальные площади в фокальной плоскости измеряли по изображению J, и на основе этих данных рассчитывался индекс избыточного периметра. Несмотря на то, что этому сообщению легко следовать, с образцами все же нужно обращаться осторожно.
