Метод пилинга позволяет разделить многослойные и концентрированные биологические крио-ЭМ-образцы на отдельные слои для уменьшения толщины, увеличения концентрации и облегчения обработки изображений. Концентрации образцов могут быть увеличены до подготовки сетки, а отшелушивание может быть скорректировано таким образом, чтобы получить плотное распределение однослойных образцов для высокоэффективного сбора данных. Для начала сложите два куска фильтровальной бумаги размером 20-25 микрометров и поместите рядом с ней длинную парафиновую пленку бумагой, обращенной вверх.
Поместите кусочек субмикронной фильтровальной бумаги поверх двух дополнительных кусочков фильтровальной бумаги. Расположите антикапиллярные щипцы с согнутой ногой вверх и прямой ногой вниз и выберите сетку из 600 сеток гладкой или блестящей стороной вверх. Поместите щипцы на чашку Петри или другую приподнятую поверхность, чтобы избежать контакта чистой сетки с другими предметами.
Снимите бумагу с парафиновой пленки и потяните по бокам, чтобы создать небольшой ободок. Пипетка две капли по 150 микролитров, так что 4% раствор трегалозы на расстоянии от одного до двух сантиметров с одной короткой стороны парафиновой пленки. Две капли должны находиться на расстоянии около одного сантиметра друг от друга.
Затем на отдельной скамейке или на полу налейте жидкий азот в небольшой контейнер из пенополистирола и поместите небольшой контейнер с крио-ЭМ-сеткой в жидкий азот. Накройте контейнер из пенополистирола безворсовыми салфетками. Чтобы вытащить углеродную пленку из слюды, используйте щипцы Дюмона 5 и коснитесь одной стороны слюды под небольшим углом вниз на одной из капель раствора трегалозы.
Переместите слюду вниз, чтобы натяжение воды медленно отрывало углеродную пленку. Выпустите слюду, как только углеродная пленка всплывет на поверхности капли. Визуально осмотрите углеродную пленку, чтобы избежать использования углерода с повреждениями в виде трещин.
Вставьте сетку, удерживаемую антикапиллярными щипцами под углом 20-30 градусов, в трегалозную каплю в положении, прилегающем к углеродной пленке, а затем центрируйте сетку под углеродной пленкой. Возьмите углеродную пленку, держите сетку в той же ориентации и медленно опустите сетку на поверхность второй капли трегалозы, не нарушая поверхностного натяжения капли. Это удалит ненужную углеродную пленку, которая, возможно, обернута вокруг края сетки в шероховатую сторону.
Поверните антикапиллярные щипцы и поместите их на чашку Петри углеродной стороной сетки лицом вниз. Пипетка 1,3 микролитра образца в легкий трегалозный мениск поверх сетки. Затем пипеткой раствор примерно 8-10 раз перемешать и распределить трегалозу и образец по обеим сторонам сетки.
Пипетка одной или более 1,7 микролитровых капель раствора трегалозы на парафиновую пленку при инкубации образца раствора трегалозы на сетке в течение одной минуты. Поверните сетку обратно в исходное положение с помощью углеродной пленки, обращенной вверх, и прижмите сетку к субмикронной фильтровальной бумаге с помощью антикапиллярных щипцов. После того, как раствор был поглощен фильтровальной бумагой и углеродная пленка лежит ровно, подождите три секунды, прежде чем поднять сетку и переместить ее вертикально на 1,7 микролитр капли раствора трегалозы.
Эти шаги могут быть повторены от одного до трех повторений или более, в зависимости от образца. Промокните сетку на двух листах фильтровальной бумаги, а затем снимите сетку с фильтровальной бумаги. Примерно через 13 секунд, в зависимости от влажности и буфера образца, погрузите сетку в жидкий азот в небольшой контейнер из пенополистирола и поместите его в контейнер для крио-ЭМ сетки или передайте его непосредственно для крио-ЭМ скрининга или сбора данных.
Здесь показан 2D образец кристалла человеческой лейкотриен-С4-синтазы, подвергнутой методу пилинга-блоттинга. Область слева от стрелки была в значительной степени уменьшена до однослойных 2D-кристаллов в области контакта между углеродной пленкой и полосой сетки, которая была очищена, а затем смещена. Область справа от стрелки не была затронута шелушением-пятном.
Нижняя половина изображения представляет собой области с большими, в основном однослойными фосфолипидными бислоями, возникающими в результате нанесения пилинга-блоттинга. Верхняя половина не находилась в зоне контакта между стержнем сетки и углеродной пленкой и, таким образом, содержала полные липосомы с двумя фосфолипидными бислоями. Квадрат сетки сетки из 400 ячеек показывает площадь полосы сетки и результирующие отслаивающиеся области, а также области, которые не контактировали с полосой сетки или подвергались меньшему количеству итераций шелушения.
Эти изображения показали промокание ЭМ-сетки, подготовленной обратной инъекцией на субмикронной фильтровальной бумаге с использованием очень тонкой углеродной пленки. Изображения представляют собой одиночные кадры при первоначальном контакте с мембраной, 1 000 миллисекунд после контакта и 2 000 миллисекунд после контакта. Стрелка указывает квадраты сетки, где капиллярное давление разорвало углеродную пленку.
Предотвращение трещин в углеродной пленке и объединение субмикронной фильтровальной бумаги с 1,7 микролитром трегалозной капли для всасывания, а затем разделения слоев являются ключевыми шагами. Отслаивающиеся образцы используются для сбора крио-ЭМ данных высокого разрешения с последующей обработкой изображений для определения структуры. Шелушение-пятно позволяет структурированно определять однослойные белковые 2D-кристаллы, которые ранее были слишком толстыми для крио-ЭМ.
Кроме того, он может концентрировать различные образцы в отдельные слои на углеродной пленке.
