Стандартная пробоподготовка затрудняет достижение хорошего сигнала-шума во время рентгеновских дифракционных экспериментов микрокристаллов. Этот протокол направлен на контролируемое сокращение источников фоновых образованных кристаллов. Использование робототехники перфораторной заморозки и сеток cryoTEM обеспечивает надежную платформу для многократного манипулирования микрокристаллами, уменьшая объем окружающей жидкости и обеспечивая быструю витрификацию образца.
Ловкость, необходимая для обработки сеток, аналогична той, которая необходима для традиционного сбора кристаллов. Другим важным фактором является определение начальных параметров промокшивания с использованием кристаллизационного раствора, что является ключом к сокращению использования образца. Для начала настройте и охладите автоматизированную морозильную камеру в соответствии с инструкциями производителя.
Непосредственно перед использованием разряжайте сетки cryoTEM в течение 25 секунд с током 15 миллиампер и давлением 0,39 миллибар, затем храните сетки тлеющего разряда в покрытой чашке Петри. Установите относительную влажность пробной камеры на 90%, а время промоктирования на пять секунд. Убедитесь, что морозильная камера настроена на автоматическое погружение образца после завершения блоттинга.
Откройте уплотнение кристаллизационого колодца и резервуара. Быстро добавляйте от двух до пяти микролитров резервуарного раствора в кристаллическую каплю для поддержания объема капли. Переложите 10 микролитров пластового раствора в трубку объемом 0,5 миллилитра для последующего использования и повторно засвершите скважину, чтобы предотвратить высыхание капли кристаллизации.
Используйте погружные морозильные щипцы, чтобы выбрать одну сетку нагнетания на тлеющего нагнетания и загрузить сетку в инструмент углеродной стороной, обращенной в сторону от пятнистого рычага. Поверните щипцы, удерживающие сетку, так, чтобы карбоновая сторона была обращена к пятнистой руке. Используйте пипетку объемом 2,5 микролитра для нанесения двух микролитров резервуарного раствора на ненесущую сторону сетки cryoTEM.
Поверните сетку углеродной стороной, обращенной в сторону от пятнистого рычага, и осторожно нанесите резервуарную жидкость на опорную сторону сетки из углеродной пленки. Инициируйте процесс промоктирования и наблюдайте за жидкостью, извлеченной из углеродной поверхности, пока не будет видна волна хлопнувания по поверхности сетки. Если волна хлопка не видна, увеличьте время пятнистости на одну-две секунды, прежде чем пятнистая рука втянется из сетки.
Поместите кристаллизуальную пластину под световой микроскоп и поместите цель в поле зрения. Поместите свежую сетку тлеющего разряда в погружную морозильную камеру и нанесите резервуарную жидкость на неокрепежную сторону сетки, как показано ранее. Поверните сетку стороной опоры из углеродной пленки лицом к отверстию для отбора проб погружной морозильной камеры.
Снимите временное уплотнение с кристаллизационный лист и используйте пипетку, установленную на два микролитра, чтобы аккуратно аспирировать каплю кристаллизации многократно. Перенесите два микролитра аспирированной микрокристаллической суспензии в погружную морозильную камеру и нанесите весь образец на углеродную сторону сетки cryoTEM. Инициируйте блоттинг и наблюдайте за волной хлопка, затем немедленно инициируйте погружение замораживания.
Быстро перенесите сетку из жидкого этана в сетку, погруженную в жидкий азот. После промокания и погружения, замораживания сетки, втяните погруженную сетку из жидкого этана, сбросив морозильную камеру. Извлеките щипцы, удерживающие сетку, из морозильной камеры и поместите сетку под световой микроскоп.
Отрегулируйте тонкую фокусировку и оцените плотность кристаллов по всей сетке. После загрузки сетки cryoTEM в SEM выровняйте образец и включите электронный пучок. Первоначально оцените всю сетку при 45-кратном увеличении и запишите изображение, затем увеличьте увеличение для более тщательного изучения отдельных квадратов сетки до тех пор, пока отдельные кристаллы не будут четко замечены.
Перемещайтесь по сетке и захватывайте неподвижные изображения, гарантируя, что решетки плоские, а углеродная опорная пленка в значительной степени неповреждена. Убедитесь, что в кристалле есть многочисленные монокристаллы с узким ореолом остеклованной жидкости, и отверстия видны в углеродной опорной пленке. Наблюдая и захватывая изображения сетки, убедитесь, что большие области остеклованной жидкости отсутствуют, гексагональный лед или поверхностный лед не разбросаны по сетке, и что кристаллы не перекрываются и равномерно распределены по опорной пленке.
В большом пенопластовом дьюаре охладите необходимое количество держателей образцов VMXm, загруженных в картридж для образцов. Добавьте жидкий азот выше положения образца в загрузчике проб. Быстро перенесите сетчатый ящик, содержащий сетки, нагруженные микрокристаллом, в углубление сетчатого ящика на загрузчике образцов и слегка открутите крышку, чтобы крышка была свободной и вращающейся.
Поднимите сетку из коробки сетки и поверните сетку, чтобы положить сетку плоско на держатель образца. Быстро поместите предварительно охлажденный инструмент кругового скольжения над сеткой в отверстии сетки и нажмите кнопку, чтобы установить циркульпан. Добавьте жидкий азот примерно на 1,5 сантиметра выше держателя образца.
Используйте щипцы для образцов VMXm, чтобы осторожно поднять держатель загруженного образца и поместить его обратно в картридж для образцов. Замените крышку картриджа, убедив, что штифт в верхней части картриджа взаимодействует с отверстием в крышке. Сканирующая электронная микрофотография микрокристалла, подготовленная на сетках cryoTEM, показала минимальный фоновый рассеяние.
Сетка была свободна от избыточной жидкости, и вокруг кристаллов наблюдался узкий ореол жидкости. Многогранные кристаллы наблюдались как по отдельности, так и в сгустках. Немного более крупные кристаллы инсулина также показали некоторое слипание вместе с изолированными кристаллами.
Очень крупные микрокристалла также были успешно установлены на сетках cryoTEM. Отверстия в углеродной опорной пленке были хорошо видны, что указывает на сильное пятно. Многие образцы требовали дальнейшей оптимизации из-за изменения времени блоттинга и концентрации микрокристаллов.
Сетки, перегруженные кристаллами, снижают эффективность промокления, и несколько решеток были записаны на одном дифракционном изображении. Короткое время промокания для высоковязких кристаллизационных растворов может привести к чрезмерно влажному образцу. Для раствора кристаллизации с более низкой вязкостью короткое время промокшения приводит к краже микрокристаллов на одной стороне решеток.
Оптимальная пробоподготовка позволяет использовать все возможности VMXm для сбора высококачественных рентгеновских дифракционных данных с максимально возможным разрешением с высоким отношением сигнал/шум. Определение начального промокления кристаллизационного раствора является ключом к использованию минимального образца. Если выборка очень ограничена, пропустите оценку плотности.
В конечном счете, лучше иметь разбавленный образец. Эти образцы теперь готовы к экспериментам по дифракции рентгеновских лучей на VMXm Beamline, микрокристаллической электронной дифракции или фрезерованию сфокусированного ионного пучка до микро ЭД.
