La technique peel-blot permet de séparer des échantillons cryo-EM biologiques multicouches et concentrés en couches uniques pour réduire l’épaisseur, augmenter la concentration et faciliter le traitement de l’image. Les concentrations de l’échantillon peuvent être augmentées avant la préparation de la grille, et le transfert de peau peut être ajusté pour obtenir une distribution dense des échantillons à couche unique pour une collecte de données très efficace. Pour commencer, empilez deux morceaux de papier filtre de format pore de 20 à 25 micromètres et placez un long film de paraffine à côté avec le papier tourné vers le haut.
Placez un morceau de papier filtre submicronique sur deux morceaux supplémentaires de papier filtre. Positionnez la pince anticapillaire avec la jambe pliée vers le haut et la jambe droite vers le bas et sélectionnez une grille de 600 mailles avec le côté lisse ou brillant vers le haut. Placez les pinces sur une boîte de Petri ou une autre surface surélevée pour éviter le contact de la grille propre avec d’autres articles.
Retirez le papier du film de paraffine et tirez sur les côtés pour créer un petit bord. Pipeter deux gouttes de 150 microlitres donc une solution de tréhalose à 4% à environ un à deux centimètres d’un côté court du film de paraffine. Les deux gouttes doivent être distantes d’environ un centimètre.
Ensuite, sur un banc séparé ou sur le sol, versez de l’azote liquide dans un petit récipient en mousse de polystyrène et placez un petit récipient cryo-EM dans l’azote liquide. Couvrir le contenant en mousse de polystyrène avec des lingettes non pelucheuses. Pour faire flotter le film de carbone du mica, utilisez une pince Dumont 5 et touchez un côté du mica à un léger angle vers le bas sur l’une des gouttes de solution de tréhalose.
Déplacez le mica vers le bas pour laisser la tension de l’eau se soulever lentement du film de carbone. Libérez le mica une fois que le film de carbone flotte à la surface de la gouttelette. Inspectez visuellement le film de carbone pour éviter d’utiliser du carbone endommagé sous forme de fractures.
Insérez la grille maintenue par la pince anticapillaire à un angle de 20-30 degrés dans une goutte de tréhalose à une position adjacente, puis centrez la grille sous le film de carbone. Ramassez le film de carbone, maintenez la grille dans la même orientation et abaissez lentement la grille sur la surface de la deuxième goutte de tréhalose sans briser la tension superficielle de la goutte. Cela éliminera le film de carbone inutile qui aurait pu s’enrouler autour du bord de la grille du côté rugueux.
Faites pivoter les pinces anti-capillaires et placez-les sur une boîte de Pétri avec le côté carbone de la grille vers le bas. Pipeter 1,3 microlitre de l’échantillon dans le ménisque léger tréhalose sur le dessus de la grille. Ensuite, pipeter la solution environ 8 à 10 fois pour mélanger et répartir le tréhalose et l’échantillon des deux côtés de la grille.
Pipeter une ou plusieurs gouttes de 1,7 microlitre de solution de tréhalose sur le film de paraffine tout en incubant l’échantillon de solution de tréhalose sur la grille pendant une minute. Faites pivoter la grille dans sa position d’origine avec le film de carbone vers le haut et appuyez sur la grille sur le papier filtre submicronique à l’aide de la pince anti-capillaire. Une fois que la solution a été absorbée par le papier filtre et que le film de carbone est à plat, attendez trois secondes avant de soulever la grille et de la déplacer verticalement sur la goutte de 1,7 microlitre de solution de tréhalose.
Ces étapes peuvent être répétées entre une et trois réitérations ou plus, selon l’échantillon. Épongez la grille sur les deux morceaux de papier filtre, puis soulevez la grille du papier filtre. Après environ 13 secondes, selon l’humidité et le tampon de l’échantillon, plongez la grille dans l’azote liquide dans le petit récipient en polystyrène expansé et placez-la dans le récipient cryo-EM ou transférez-la directement pour le dépistage cryo-EM ou la collecte de données.
Un échantillon cristallin 2D de leucotriène C4 synthase humaine soumis à la méthode peel-blot est montré ici. La région à gauche de la flèche a été largement réduite à des cristaux 2D monocouches dans une région de contact entre le film de carbone et la barre de grille qui a été écaillée puis déplacée. La région située à droite de la flèche n’a pas été affectée par la tache pelée.
La moitié inférieure de l’image représente les régions avec de grandes bicouches phospholipidiques, principalement monocouches, résultant de l’application du peel-blot. La moitié supérieure n’était pas dans une zone de contact entre la barre de grille et le film de carbone, et contenait donc des liposomes complets avec deux bicouches phospholipidiques. Le carré de la grille d’une grille de 400 mailles montre l’empreinte de la barre de grille et les régions écaillées résultantes, ainsi que les régions qui n’étaient pas en contact avec une barre de grille ou soumises à moins d’itérations de transfert de pelage.
Ces images montraient le buvard d’une grille EM préparée par rétroinjection sur un papier filtre submicronique utilisant un film de carbone très fin. Les images sont des images uniques au contact initial avec la membrane, 1 000 millisecondes après le contact et 2 000 millisecondes après le contact. La flèche indique les carrés de la grille où la pression capillaire a rompu le film de carbone.
Éviter les fractures dans le film de carbone et combiner du papier filtre submicronique avec une goutte de tréhalose de 1,7 microlitre pour aspirer puis séparer les couches sont des étapes clés. Les échantillons épluchés sont utilisés pour la collecte de données cryo-EM à haute résolution, suivie d’un traitement d’image pour la détermination de la structure. Le peel-blot permet une détermination structurée des cristaux 2D de protéines monocouches qui étaient auparavant trop épais pour la cryo-EM.
En outre, il peut concentrer divers échantillons en couches uniques sur un film de carbone.
