Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области иммунотерапии об оценке цитотоксичности иммунных клеток против опухолевых клеток 3D-структуры. Основные преимущества этого метода в том, что он прост и сочетает в себе передовые технологии визуализации и чувствительный иммунологический анализ. Начните с мытья колоректальной линии раковых клеток, представляющих интерес с пятью миллилитров PBS и удаления клеток из колбы дно с 0,5 миллилитров трипсина в течение пяти минут при 37 градусов по Цельсию.
Подтвердив отслоение под микроскопом, нейтрализуем фермент диссоциации клеток с помощью 10 миллилитров полной среды и собирайте клетки путем центрифугации. Переусердуйте гранулы в пяти миллилитров свежей полной среды для подсчета и повторного перерасхода клеток в 1,5 раза от 10 до третьих клеток на миллилитр концентрации. Затем семя 200 микролитров клеток в каждой колодец 96-хорошо круглой нижней пластины и поместите пластину в автоматизированный аппарат визуализации внутри 37 градусов по Цельсию инкубатор с 5%CO2 и 95% влажности.
Войдите в программное обеспечение для приобретения аппарата и выберите Расписание для приобретения, запуска добавить судно, сканировать по расписанию, и создать судно новое. Далее выберите тип сканирования Spheroid и выберите соответствующие ярко-полевые и флуоресцентные каналы, представляющие интерес. Установите увеличение в 10 раз и выберите модель пластины и ее положение в ящике аппарата визуализации.
Выберите положение колодцев для изображения и введите описание эксперимента, включая название, тип ячеек и количество ячеек. Для настройки анализа выберите анализ отсрочки до более поздних дней, нажмите правой кнопкой мыши на временной шкале, а также выберите интервал выбранной группы сканирования и установите Add Scans каждые четыре часа и в общей сложности до 24 часов. Затем установите время начала, по крайней мере, через час после инкубации в автоматизированном аппарате визуализации.
Чтобы проверить прогресс роста сфероидов, каждые два дня войдите в программное обеспечение для визуализации и выберите Просмотр последних сканирований. Дважды нажмите на эксперимент, представляющий интерес, и выберите Brightfield в панели каналов изображения. Затем используйте инструмент Функции измерения изображения для измерения диаметра сфероидов, добавляя 50 микролитров полной среды на колодец на четвертый день, чтобы ограничить любые эффекты среднего испарения.
Когда сфероиды достигают соответствующего экспериментального размера, тщательно угол пластины и использовать многоканальную пипетку, чтобы аккуратно удалить 150 микролитров полной среды из каждого хорошо, не нарушая сфероидов. Затем замените отбрасываемую среду на 50 микролитров раствора Annexin V Red и поместите пластину в инкубатор клеточной культуры на 15 минут. Центрифуга трансдуцированных CAR CD19 Т-клеток в 15 миллилитров конической трубки и повторно гранулы в двух миллилитров полной среды.
После подсчета, разбавить клетки в два раза от 10 до пятой клетки на миллилитр полной средней концентрации. Затем добавьте 100 микролитров клеток CAR CD19 T к каждому сфероидно-содержащему колодец и верните пластину в автоматизированный аппарат визуализации. В программном обеспечении для приобретения выберите Расписание для приобретения и нажмите правой кнопкой мыши на Хронике сканирования.
Выберите Хронологию редактирования и нажмите правой кнопкой мыши на группу сканирования, чтобы удалить ее. Нажмите на Хронику снова и выберите Набор Выбранный интервал группы сканирования и установите Добавить сканирование каждые 1 1 / 2 часа и в общей сложности до 24 часов. Затем установите время начала изображения по крайней мере через час после начала инкубации в автоматизированном аппарате визуализации и выберите Сохранение Расписание сканирования.
Для автоматизированного анализа изображений в программном обеспечении сканирования выберите просмотр последних сканирований и анализ запуска. Выберите Создание нового определения анализа и анализа типа сфероидов и установите каналы изображения для анализа. Выберите не менее 10 репрезентативных изображений и просмотрите процедуру анализа по умолчанию на всем стеке изображений.
Измените параметры ярко-полевой маски и просмотрите стек изображения, подтвердив, что выбранные параметры точно обнаруживают сфероиды. Измените параметры зеленой маски и просмотрите стек изображения, чтобы подтвердить, что выбранные параметры точно обнаруживают сфероиды. Измените параметры красной маски и просмотрите стек изображения, чтобы подтвердить, что выбранные параметры точно обнаруживают сфероиды.
Позаботьтесь о том, чтобы достичь наилучшего сигнала по шуму и чувствительности по отношению к специфичности, имея в виду, что вы не сможете найти набор параметров, которые позволят запечатлеть каждое событие в любой момент времени. Затем запустите анализатор. Когда анализ будет завершен, извлекайте измерение интереса и выберите проанализированный файл и параметр метрик графа.
Выберите показатели, представляющие интерес, сканирование и колодец. Нажмите Export Data для извлечения выбранных метрик в нескольких форматах файлов. Затем, чтобы извлечь изображения, выберите анализируемый файл и выберите Export Images and Movies.
Выражение CD19 CAR на трансинированных Т-клеток и выражение CD19 на трансинированных колоректальных раковых клетках может быть подтверждено цитометрией потока. Здесь можно наблюдать результаты типичного сфероидного эксперимента. В отличие от макетА Т-клеток, CD19 CAR Т-клетки способны специально убить колоректальных раковых клеток линии полученных сфероидов, значительно уменьшая количество живых опухолевых клеток.
Отслеживание эволюции общего зеленого и красного сигналов в пределах сфероидных границ с течением времени показывает, что вскоре после CD19 CAR T-клеток инъекции, размер сфероидов быстро уменьшается, как апоптоз сигнал быстро увеличивается. После этой процедуры, другие методы, такие как анализ токсичности, анализ миграции клеток, или измерения структуры сфероидов могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы о скрининге наркотиков, подвижности Т-клеток, или образование сфероидов, соответственно.
