Этот протокол полезен во многих биологических и токсикологических исследованиях медоносных пчел, обработанных пестицидами. Он помогает обнаружить клеточные реакции ткани медоносных пчел на акарициды, которые используются в пчелиных семьях для лечения против клещей Варроа. Это мощный инструмент для обнаружения суб-малого воздействия на ткани в сочетании с поведением пчел или других полезных насекомых.
Для начала осторожно возьмите рабочую пчелу с щипцами и положите ее на лед или морозильную камеру при минус 20 градусах Цельсия на две минуты, чтобы обездвижить ее. Прижмите пчелу к чашке Петри по диагонали через самую верхнюю заднюю часть грудной клетки дважды слева направо и справа налево. Плохое насекомое физиологическим раствором покрывает тело.
Поместите чашку Петри под стереомикроскоп, сфокусируйте и отрегулируйте. Чтобы рассечь среднюю кишку, начните с живота, вставив одну точку ножниц под тергит А5 в центр правой стороны тела пчелы. Вырезать до тергита А2. Держите внутреннее лезвие ножниц параллельно боковой части тела, чтобы избежать повреждения внутренних органов.
Поверните ножницы влево и отрежьте. Аккуратно откройте левую часть живота и приколите ее. С помощью щипцов одной рукой аккуратно потяните желудок медоносной пчелы вверх, а ножницами в другой руке срежьте в самом конце пищевода.
Оттяните живот и среднюю кишку от живота и срежьте прямую кишку. Используйте пипетку с солевым раствором насекомых и удалите любые калы или части ткани. Для рассечения гипофарингеальных желез обездвижите рабочую пчелу на льду, как описано выше.
Отрежьте голову и поместите ее на меньшую пластину с антенной вверх. Закрепите голову двумя штифтами, один через левый составной глаз, а второй через правый составной глаз. Сделайте разрез поперек первого составного глаза на внутренней стороне штифтов, продолжайте движение к лабруму, а затем сделайте еще один разрез на другой стороне через второй составной глаз.
Отрежьте усики. Снимите маску и срежьте там, где еще прикреплены. Возьмите щипцы и аккуратно удалите железы вместе с мозгом и частью сложных глаз.
Для окрашивания гематоксилина и эозина поместите депараксированные, регидратированные участки в гематоксилин на пять минут. Затем аккуратно поместите их под проточную водопроводную воду на две минуты. Затем поместите их в дистиллированную воду на одну минуту и эозин на четыре минуты.
Поместите слайды 96% этанола в течение одной минуты, затем 2-пропанола в течение двух минут и, наконец, в очищающее средство на две минуты. Добавьте монтажную среду и защитное стекло и дайте им высохнуть. Наблюдайте под световым микроскопом.
Приготовьте банки Коплина. Готовят протеиназу-К. После депарафинизации и регидратации секций поместите слайды в PBS на пять минут.
Поместите слайды в контейнер и добавьте протеиназу-К. Промойте горки в дистиллированной воде. Закалка в эндогенной пероксидазе при комнатной температуре.
Промойте горки PBS или водой. Поместите слайды в контейнер и примените буфер равновесия на 10 секунд при комнатной температуре. После протирания вокруг ткани добавляют терминальный фермент дезоксинуклеотидилтрансферазы к каждому участку и инкубируют в увлажненной камере в течение одного часа при 37 градусах Цельсия.
Перед инкубацией положите смоченные бумажные полотенца внутрь лотка вокруг горок и накройте их полиэтиленовой пленкой. После инкубации положите экземпляры на стойку и оставьте их в буфере стоп-промывки. После мытья горок в PBS и протирания вокруг тканей добавьте две капли теплой антидигоксигенинпероксидазы, конъюгированной в срезы и высиживайте в течение 30 минут в увлажненной емкости.
После промывки в PBS, подготовьте рабочую прочно-пероксидазную подложку, накройте участки пероксидазной подложкой и окрашивайте в течение пяти минут. Поместите слайд под микроскоп и определите оптимальное время окрашивания. После мытья горок в окрасочной стойке и дистиллированной воде высиживать горки в дистиллированной воде в течение пяти минут.
Противопоставьте пятно с использованием гематоксилина в течение двух минут. Вымойте горки, поместив их под проточную водопроводную воду на три минуты, а затем в дистиллированную воду. Установите горки под стеклянные крышки и монтажную среду и оставьте плоскими для высыхания.
Наблюдайте под световым микроскопом. Процент пораженных клеток рассчитывали с помощью светового микроскопа. Результаты показали, что лечение щавелевой кислотой значительно повлияло на клетки в средней кишке.
Иммуноокрашивание показало положительные красные или коричневые продукты реакции в апоптотических ядрах гипофарингеальных желез. Положительная реакция продукта после лечения имидаклопридом или кумафосом определялась в большинстве железистых клеток. При снятии маски с пчелиной головы следите за тем, чтобы не повредить и не оторвать части гипофарингеальных желез.
Этот метод обнаруживает субклинические изменения у пчел, а также подходит для обнаружения других воздействий окружающей среды на пчел и некоторые другие живые организмы.
