Bu protokol, pestisitlerle tedavi edilen bal arılarının birçok biyolojik ve toksikolojik çalışmasında yararlıdır. Varroa akarlarına karşı tedavi için arı kolonilerinde kullanılan akarisitlerin bal arısı dokusunun hücresel yanıtlarını tespit etmeye yardımcı olur. Arıların veya diğer faydalı böceklerin davranışlarıyla birlikte doku üzerindeki küçük etkilerin tespiti için güçlü bir araçtır.
Başlamak için, forsepsli bir işçi arıyı dikkatlice alın ve hareketsiz hale getirmek için iki dakika boyunca eksi 20 santigrat derecede buz veya dondurucuya koyun. Arıyı Petri kabına çapraz olarak göğüs kafesinin en üst arka kısmından soldan sağa ve sağdan sola iki kez sabitleyin. Vücudu örtmek için zayıf böcek salini.
Petri kabını stereomikroskop altına yerleştirin, odaklanın ve ayarlayın. Midgutu diseke etmek için, arı vücudunun sağ tarafının ortasındaki tergit A5'in altındaki makasın bir noktasını yerleştirerek karın ile başlayın. Tergite A2'ye kesin. İç organlara zarar vermemek için makasın iç bıçağını vücudun yan tarafına paralel tutun.
Makası sola çevirin ve kesin. Karnın sol kısmını yavaşça açın ve sabitleyin. Bir elinizle forseps kullanarak, bal arısı midesini yavaşça yukarı doğru çekin ve diğer yandan makasla yemek borusunun en sonunda kesin.
Mideyi ve midgutu karından uzaklaştırın ve rektumda kesin. Böcek salin çözeltisi içeren bir pipet kullanın ve dışkıyı veya dokunun parçalarını çıkarın. Hipofaringeal bezlerin diseksiyonu için, daha önce tarif edildiği gibi buz üzerinde bir işçi arıyı hareketsiz hale getirin.
Kafayı kesin ve anten yukarı bakacak şekilde daha küçük bir plakaya yerleştirin. Kafayı, biri sol bileşik gözden, ikincisi sağ bileşik gözden olmak üzere iki pimle sabitleyin. Pimlerin iç tarafındaki ilk bileşik göz boyunca bir kesim yapın, labruma devam edin ve ardından ikinci bileşik göz boyunca diğer tarafta başka bir kesim yapın.
Antenleri kesin. Maskeyi çıkarın ve hala takılı olan yerde kesin. Forsepsleri alın ve bezleri beyin ve bileşik gözlerin bir kısmı ile birlikte dikkatlice çıkarın.
Hematoksilin ve eozin boyama için, mumdan arındırılmış, rehidre edilmiş bölümleri beş dakika boyunca hematoksilin içine koyun. Ardından, iki dakika boyunca akan musluk suyunun altına dikkatlice yerleştirin. Ardından, onları bir dakika boyunca damıtılmış suya ve dört dakika boyunca eozin içine koyun.
Slaytları% 96 etanol, ardından iki dakika boyunca 2-propanolü ve son olarak iki dakika boyunca temizleme maddesine yerleştirin. Montaj ortamı ve bir kapak camı ekleyin ve kurumasını bekleyin. Bir ışık mikroskobu altında gözlemleyin.
Coplin kavanozları hazırlayın. Proteinaz-K hazırlayın. Bölümleri mumdan arındırdıktan ve yeniden sulandırdıktan sonra, slaytları beş dakika boyunca PBS'ye yerleştirin.
Slaytları kaba düz bir şekilde yerleştirin ve proteinaz-K ekleyin. Slaytları damıtılmış suda yıkayın. Endojen peroksidazda oda sıcaklığında söndürün.
Slaytları PBS veya su ile durulayın. Kızakları kaba düz bir şekilde yerleştirin ve oda sıcaklığında 10 saniye boyunca denge tamponu uygulayın. Dokunun etrafını sildikten sonra, terminal deoksinükleotidil transferaz enzimini her bölüme ekleyin ve nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin.
Kuluçkadan önce, slaytların etrafındaki tepsinin içine nemlendirilmiş kağıt havlular koyun ve plastik ambalajla örtün. Kuluçkadan sonra, örnekleri rafa koyun ve durdurma-yıkama tamponunda bırakın. Slaytları PBS'de yıkadıktan ve dokuların etrafını sildikten sonra, bölümlere iki damla ılık anti-digoxigenin peroksidaz konjugatı ekleyin ve nemlendirilmiş bir kapta 30 dakika boyunca inkübe edin.
PBS'de yıkadıktan sonra, çalışma mukavemeti-peroksidaz substratını hazırlayın, bölümleri peroksidaz substratı ile örtün ve beş dakika boyunca lekeleyin. Slaytı mikroskop altına yerleştirin ve en uygun boyama süresini belirleyin. Slaytları bir boyama rafında ve damıtılmış suda yıkadıktan sonra, slaytları beş dakika boyunca damıtılmış suda inkübe edin.
İki dakika boyunca hematoksilin kullanarak karşı leke. Slaytları üç dakika boyunca akan musluk suyunun altına ve daha sonra damıtılmış suya yerleştirerek yıkayın. Kızakları cam kapak kaymalarının ve montaj ortamının altına monte edin ve kuruması için düz bırakın.
Bir ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Etkilenen hücrelerin yüzdesi bir ışık mikroskobu kullanılarak hesaplandı. Sonuçlar, oksalik asitle yapılan tedavinin midguttaki hücreleri önemli ölçüde etkilediğini göstermiştir.
İmmün boyama, hipofaringeal bezlerin apoptotik çekirdeklerinde pozitif kırmızı veya kahverengi reaksiyon ürünleri gösterdi. Glandüler hücrelerin çoğunda imidacloprid veya coumaphos tedavisi sonrası pozitif reaksiyon ürünü belirlendi. Arı kafasının maskesini kaldırırken, hipofaringeal bezlerin parçalarına zarar vermemeye veya çıkarmamaya dikkat edin.
Bu teknik, arılardaki subklinik değişiklikleri tespit eder ve arılar ve diğer bazı canlı organizmalar üzerindeki diğer çevresel etkilerin tespiti için de uygundur.
