このプロトコルは、農薬で処理されたミツバチの多くの生物学的および毒物学的研究に役立ちます。それは、バロアダニに対する治療のためにミツバチのコロニーで使用されるダニ駆除剤のミツバチ組織の細胞応答を検出するのに役立ちます。これは、ミツバチや他の有益な昆虫の行動と組み合わせて、組織へのわずかな影響を検出するための強力なツールです。
はじめに、働き蜂を鉗子で慎重に取り、摂氏マイナス20度で氷上または冷凍庫に2分間置いて固定します。ペトリ皿に蜂を胸部の一番上の背中の部分を左から右、右から左に2回斜めに固定します。体を覆うための貧弱な昆虫食塩水。
ペトリ皿を実体顕微鏡の下に置き、焦点を合わせて調整します。中腸を解剖するには、ミツバチの体の右側の中央にあるテルガイトA5の下にハサミの1点を挿入して腹部から始めます。テルガイトA2にカットします。内臓を傷つけないように、はさみの内刃を体の側面と平行に保ちます。
はさみを左に回して切ります。腹部の左側をそっと開いて固定します。片手で鉗子を使用して、ミツバチの胃をそっと上に引き上げ、もう一方の手でハサミで食道の端を切ります。
胃と中腸を腹部から引き離し、直腸を切ります。昆虫食塩水を入れたピペットを使用し、糞便や組織の一部を取り除きます。下咽頭腺の解剖のために、前述のように働き蜂を氷の上に固定します。
ヘッドを切り取り、アンテナを上に向けて小さなプレートに置きます。左複眼と右複眼の2本のピンで頭を固定します。ピンの内側の最初の複眼を横切って切り込みを入れ、唇に続き、次に2番目の複眼を横切って反対側に別の切り込みを入れます。
アンテナを切り取ります。マスクを持ち上げて、まだ取り付けられている場所で切ります。鉗子を取り、脳と複眼の一部と一緒に腺を慎重に取り除きます。
ヘマトキシリンおよびエオジン染色の場合は、脱ワックス、再水和した切片をヘマトキシリンに5分間入れます。次に、水道水の下に2分間注意深く置きます。次に、蒸留水に1分間、エオシンに4分間入れます。
スライドを96%エタノールで1分間、次に2-プロパノールを2分間、最後に透明化剤に2分間入れます。封入剤とカバーガラスを加え、乾燥させます。光学顕微鏡で観察する。
コプリンジャーを準備します。プロテイナーゼ-Kを準備します。セクションを脱ろうして水分補給した後、スライドをPBSに5分間入れます。
スライドを容器に平らに置き、プロテイナーゼ-Kを加えます。スライドを蒸留水で洗います。室温で内因性ペルオキシダーゼでクエンチします。
スライドをPBSまたは水ですすいでください。スライドを容器に平らに置き、室温で10秒間平衡化バッファーを適用します。組織の周りを拭いた後、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を各切片に加え、加湿チャンバー内で摂氏37度で1時間インキュベートします。
インキュベーションの前に、湿らせたペーパータオルをスライドの周りのトレイの内側に入れ、ラップで覆います。インキュベーション後、検体をラックに置き、ストップウォッシュバッファーに入れます。スライドをPBSで洗浄し、組織の周りを拭いた後、2滴の温かい抗ジゴキシゲニンペルオキシダーゼコンジュゲートを切片に加え、加湿容器中で30分間インキュベートする。
PBSで洗浄した後、作業強度-ペルオキシダーゼ基質を準備し、切片をペルオキシダーゼ基質で覆い、5分間染色します。スライドを顕微鏡の下に置き、最適な染色時間を決定します。染色ラックと蒸留水でスライドを洗浄した後、スライドを蒸留水で5分間インキュベートします。
ヘマトキシリンを2分間使用して対比染色します。スライドを水道水の下に3分間置き、次に蒸留水に入れて洗ってください。スライドをガラスカバースリップと封入剤の下に取り付け、平らにして乾かします。
光学顕微鏡で観察する。罹患細胞の割合は、光学顕微鏡を用いて計算した。結果は、シュウ酸による処理が中腸の細胞に有意に影響を与えることを示しました。
免疫染色は、下咽頭腺のアポトーシス核に陽性の赤色または褐色の反応生成物を示した。イミダクロプリドまたはクマフォス処理後の陽性反応生成物は、大多数の腺細胞において決定された。蜂の頭のマスクを持ち上げるときは、下咽頭腺の部分を傷つけたり引き剥がしたりしないように注意してください。
この技術は、ミツバチの無症状の変化を検出し、ミツバチや他の生物に対する他の環境影響の検出にも適しています。
