Модель сетчатки приматов, установленная в этом исследовании, мы предлагаем исследование комплексного механизма и терапевтического развития цГМФ-ПКГ-зависимого ухудшения состояния сетчатки. Эта индивидуальная модель нечеловеческих приматов резервирует подтверждение ткани сетчатки и межклеточные взаимодействия, что позволяет лучше моделировать условия in vivo. Это также сокращает использование животных и сокращает продолжительность эксперимента.
Обеспечение контрольного экспериментального подхода для исследования развития или дегенерации сетчатки. Начните приготовление эксплантатов сетчатки с промывания глазных яблок, выделенных от макак дикого типа, 10 миллилитрами 5%-ного повидон-йода в течение 30 секунд. Чтобы избежать бактериального заражения, окуните глазные яблоки в 5% раствор пенициллина стрептомицина PBS на одну минуту перед инкубацией в 10 миллилитрах среды R16 в течение пяти минут.
Затем погружают глазные яблоки в 10 миллилитров раствора белка Ace-K, предварительно подогретого до 37 градусов Цельсия и выдерживают в течение двух минут. Следующую инкубацию проведите в 10 миллилитрах один-кодного раствора R16 плюс раствор эмбриональной бычьей сыворотки в течение пяти минут. Дайте окончательно постирать в 10 миллилитрах свежего R16.
После этого отделите склеру, роговицу, радужную оболочку, хрусталик и стекловидное тело. Затем разрежьте сетчатку с четырех сторон пинцетом и ножницами. Затем используйте тонкое лезвие из четырех миллилитров, чтобы разрезать эксплантат сетчатки на расстоянии 1,5 миллиметра от носовой стороны, четырех миллиметров от височной стороны и двух миллиметров от верхней и нижней сторон головки зрительного нерва.
Затем с помощью шестимиллиметрового дерева тонким лезвием разрезают центральную сторону эксплантата сетчатки, содержащую диск зрительного нерва и макулу. Используя широкую пипетку, потяните эксплантат сетчатки, содержащий сетчатку и сосудистую оболочку, и поместите его в середину вставки фоторецепторной стороной вверх. Полностью погрузите сетчатку в один миллилитр полной среды на пластинке под мембраной.
Культивируйте эксплантаты сетчатки и поместите их в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия с увлажненным 5% углекислым газом. Дайте соответствующую концентрацию препарата для обработки эксплантатов в течение четырех дней. Используйте не менее трех эксплантатов в каждом состоянии лечения и используйте эксплантаты без препарата в качестве положительного контроля.
Для фиксации и криосекционирования обработайте эксплантаты сетчатки одним миллилитром параформного альдегида в течение 45 минут. После кратковременного промывания одним миллилитром PBS последовательно инкубируют эксплантаты в 10%-ной сахарозе в течение 10 минут, 20%-ной сахарозе в течение 20 минут и 30%-ной сахарозе в течение 30 минут. Разрежьте ретинальные эксплантаты равномерно с четырьмя квадрантами на периферии и шестью миллиметрами в центре.
Затем перенесите эксплантаты сетчатки в жестяную коробку размером примерно 1,5 на 1,5 на 1,5 сантиметра с оптимальной температурой резки составной среды, покрывающей эксплантат. Сразу же заморозьте срезы тканей в жидком азоте и поместите их в холодильник при температуре 20 градусов для хранения. Затем обрежьте агар на небольшой блок, содержащий образец ткани.
Разделите блоки на блоки по 10 микрометров и поместите срезы на предметные стекла адгезионного микроскопа с помощью мягкой щетки. Затем высушите срезы в течение 45 минут при температуре 40 градусов по Цельсию и храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию до использования. Для окрашивания циклическим гуанозинмонофосфатом или цГМФ нарисуйте гидрофобное кольцо вокруг высушенных участков сетчатки жидкой блокирующей ручкой и накройте образцы.
Погрузите предметные стекла в 200 микролитров 0,3% PBS и Triton-X100 или PBST на 10 минут с последующей часовой обработкой в 200 микролитрах блокирующего раствора при комнатной температуре. Затем инкубируйте предметное стекло образца в течение ночи с 200 микролитрами первичного антитела, приготовленного в блокирующем растворе при четырех градусах Цельсия, и трижды промойте его PBS в течение 10 минут. Инкубируют предметное стекло в 200 микролитрах вторичного антитела в течение одного часа при комнатной температуре.
После трех промывок PBS в течение 10 минут покройте образцы монтажной средой с защитой от выцветания, содержащей DAPI, и храните при температуре четыре градуса Цельсия не менее 30 минут перед визуализацией. Высушите предметное стекло при комнатной температуре в течение 15 минут и нарисуйте водоотталкивающее барьерное кольцо вокруг образца ткани сетчатки с помощью ручки-блокатора жидкости. После инкубации с 40 миллилитрами PBS в течение 15 минут обрабатывают срезы 42 миллилитрами 0,05 молярного трис-буфера или TBS при 37 градусах Цельсия.
Аспирируйте TBS, инкубируйте образцы с шестью микролитрами протеиназы K в течение пяти минут и трижды промойте предметные стекла PBS по пять минут каждый. Подвергните предметные стекла воздействию 40 миллилитров раствора этиловой уксусной кислоты в чаплине. Накройте его прозрачным листом и выдерживайте при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение пяти минут.
Трижды промойте предметные стекла с помощью TBS в течение пяти минут каждый раз. Подвергните предметные стекла воздействию 200-300 микролитров блокирующего раствора или 1% BSA и инкубируйте их во влажной камере в течение одного часа. Примерно 130 микролитров красного раствора TMR на предметное стекло и через час дайте две промывки по 200 микролитров PBS в течение пяти минут каждая.
Нанесите на образцы предметные стекла, содержащие одну-две капли антибактериальной монтажной среды, с помощью DAPI и инкубируйте предметные стекла при четырех градусах Цельсия в течение не менее 30 минут перед визуализацией. После последовательного окрашивания туннелем и цГМФ приступают к световой и флуоресцентной микроскопии, регулируя параметры камеры. Сделайте снимки четырех полей из каждого раздела с помощью программного обеспечения с цифровой камерой с 20-кратным увеличением.
Получение репрезентативных изображений из центральных областей сетчатки с помощью DAPI, EGFP и TMR со сканированием z-стека и интервалом в один микрометр и опционально на 1,251 микрометра. В эксплантах сетчатки, обработанных различными концентрациями ингибиторов ФДЭ6 «Запринаст», количество туннельных и цГМФ-положительных клеток во внешнем ядерном слое было сильно увеличено по сравнению с контрольной группой. Высокая доля туннель-положительных клеток позволяет предположить, что увеличение активности цГМФ может усиливать индуцированную до гнезда дегенерацию клеток сетчатки, а накопление цГМФ играет роль в дегенерации фоторецепторов.
Подготовка эксплантата должна быть проведена как можно скорее. Op животные разбрасывают пятерки и любое накопление, потому что это улучшает выживаемость клеток и улучшает состояние волокна серии объемных стеков. В наибольшей степени видимое стекловидное тело должно быть очищено стероидами.
Избегайте контакта со слоями нервных волокон сетчатки при переносе эксплантатов сетчатки, чтобы предотвратить механическое повреждение клеток. Обратите внимание, что для выдачи плавного переноса эксплантатов сетчатки на культуральные вставки питомца можно предварительно замочить во чем-нибудь, чтобы он оставался влажным перед переносом тканей сетчатки. Кроме того, весь процесс должен выполняться в атмосфере стероидов, чтобы избежать загрязнения во время процесса.
