본 연구에서 확립된 영장류 망막 모델은 cGMP-PKG 의존성 망막 열화의 포괄적인 메커니즘 및 치료 개발에 대한 조사를 제공합니다. 이 개별 비인간 영장류 모델은 망막 조직 확인 및 세포간 상호작용을 보유하여 생체 내 조건을 더 잘 시뮬레이션할 수 있습니다. 또한 동물 사용을 줄이고 실험 기간을 단축합니다.
망막 발달 또는 변성을 조사하기 위한 대조 실험적 접근법을 제공합니다. 야생형 원숭이에서 분리된 안구를 10밀리리터의 5% 포비돈 요오드로 30초 동안 세척하여 망막 외식편 준비를 시작합니다. 박테리아 오염을 방지하려면 안구를 5% 페니실린 스트렙토마이신 PBS 용액에 1분 동안 담근 후 10밀리리터의 R16 배지에서 5분 동안 배양합니다.
그런 다음 섭씨 37도에서 예열된 단백질 Ace-K 용액 10ml에 안구를 담그고 2분 동안 배양합니다. 1 대 1 R16 플러스 태아 소 혈청 용액 10 밀리리터에서 5 분 동안 다음 배양을 수행하십시오. 신선한 R16 10 밀리리터로 최종 세척하십시오.
완료되면 공막, 각막, 홍채, 수정체 및 유리체를 분리합니다. 그런 다음 핀셋과 가위로 4면에서 망막을 자릅니다. 다음으로, 4 밀리리터 나무의 미세한 칼날을 사용하여 비강 쪽에서 1.5 밀리미터, 측두에서 4 밀리미터, 시신경 머리의 위쪽과 아래쪽에서 2 밀리미터에서 망막 이식편을 자릅니다.
이어서, 6 밀리미터 나무의 가는 칼날을 사용하여 시신경과 황반을 포함하는 망막 외식편의 중앙을 절단한다. 넓은 피펫을 사용하여 망막과 맥락막이 포함된 망막 체외이식편을 당겨 광수용체 면이 위로 향하도록 하여 삽입물 중앙에 놓습니다. 멤브레인 아래의 판에 있는 완전한 배지 1밀리리터에 망막을 완전히 담그십시오.
망막 체외이식편을 배양하고 가습된 5% 이산화탄소가 있는 섭씨 37도 인큐베이터에 넣습니다. 4 일 동안 외식편에 적절한 약물 농도 처리를하십시오. 치료 조건당 최소 3개의 외식편을 사용하고 약물 없이 외식편을 양성 대조군으로 사용하십시오.
고정 및 냉동 절편을 위해, 망막 체외이식편을 1밀리리터의 파라폼 알데히드로 45분 동안 처리한다. 1밀리리터의 PBS로 간단히 헹군 후, 체외이식편을 10분 동안 10% 수크로오스, 20분 동안 20% 슈크로스, 30분 동안 30% 슈크로오스에서 연속적으로 배양합니다. 망막 외식편을 주변에 4개의 사분면과 중앙에 6mm로 균일하게 절단합니다.
그런 다음 망막 외식편을 약 1.5 x 1.5 x 1.5cm의 주석 상자로 옮기고 체외편을 덮는 최적 절단 온도 복합 포매 배지를 사용합니다. 즉시 조직 부분을 액체 질소로 얼리고 20도 냉장고에 보관하여 보관하십시오. 다음으로, 한천을 조직 샘플이 들어 있는 작은 블록으로 자릅니다.
블록을 10마이크로미터 블록으로 분할하고 부드러운 브러시를 사용하여 접착 현미경 슬라이드에 섹션을 놓습니다. 그런 다음 섭씨 40도에서 45 분 동안 섹션을 건조시키고 사용할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 순환 구아노신 모노포스페이트 또는 cGMP 염색의 경우 액체 차단제 펜으로 건조된 망막 섹션 주위에 소수성 링을 그리고 샘플을 덮습니다.
슬라이드를 200 마이크로리터의 0.3% PBS 및 트리톤-X100 또는 PBST에 10분 동안 담근 후, 실온에서 200 마이크로리터의 블로킹 용액에 1시간 처리한다. 다음으로, 블로킹 용액에 준비된 200 마이크로리터의 1차 항체와 함께 샘플 슬라이드를 섭씨 4도에서 밤새 배양하고 PBS로 10분 동안 3회 헹굽니다. 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 2차 항체 200 마이크로리터에서 인큐베이션한다.
PBS를 10분 동안 3회 세척한 후 DAPI를 함유하는 페이드 방지 장착 매체로 샘플을 덮고 이미징 전에 섭씨 4도에서 최소 30분 동안 보관합니다. 슬라이드를 실온에서 15분 동안 건조시키고 액체 차단제 펜으로 망막 조직 표본 주위에 발수 장벽 링을 그립니다. 40 밀리리터의 PBS로 15 분 동안 배양 한 후, 섭씨 37도에서 42 밀리리터의 0.05 몰 트리스 버퍼 또는 TBS로 절편을 처리한다.
TBS를 흡인하고, 샘플을 6 마이크로리터의 프로테이나제 K로 5분 동안 배양하고, 슬라이드를 PBS로 각각 5분 동안 세 번 세척합니다. 슬라이드를 채플린의 에탄올 아세트산 용액 40ml에 노출시킵니다. 투명 시트로 덮고 섭씨 영하 20도에서 5 분 동안 배양하십시오.
매번 5 분 동안 TBS로 슬라이드를 세 번 씻으십시오. 슬라이드를 200-300 마이크로 리터의 차단 용액 또는 1 % BSA에 노출시키고 습도 챔버에서 1 시간 동안 배양합니다. 슬라이드 당 대략 130 마이크로리터의 TMR 적색 용액에서 그리고 1시간 후, 각각 5분 동안 200 마이크로리터의 PBS를 2회 세척한다.
샘플 위에 DAPI가 있는 페이드 방지 마운팅 배지 1-2방울이 들어 있는 커버 슬라이드를 놓고 이미징 전에 최소 30분 동안 섭씨 4도에서 슬라이드를 배양합니다. 터널 및 cGMP로 순차적으로 염색한 후 카메라 파라미터를 조정하여 광 및 형광 현미경 검사를 진행하였다. 20x 배율의 디지털 카메라와 함께 소프트웨어를 사용하여 각 섹션에서 4개 필드의 이미지를 캡처합니다.
DAPI, EGFP 및 TMR을 사용하여 z-스택 스캐닝과 1마이크로미터 간격 및 1.251마이크로미터에서 선택 사항으로 망막의 중앙 영역에서 대표 사진을 얻습니다. 상이한 농도의 PDE6 억제제 Zaprinast로 처리된 망막 외식편에서, 대조군에 비해 외부 핵층에서 터널 및 cGMP 양성 세포의 수가 강하게 증가하였다. 터널 양성 세포의 높은 비율은 cGMP 활성의 증가가 네스트 전 유도된 망막 세포 변성 및 cGMP 축적이 광수용체 변성에서 역할을 하는 것을 향상시킬 수 있음을 시사하였다.
이식편 준비는 가능한 한 빨리 수행해야합니다. Op 동물은 세포 생존을 향상시키고 벌크 스택 시리즈의 섬유 상태를 향상시키기 때문에 임의의 축적을 산란시킨다. 유리체는 최대한 눈에 띄게 스테로이드로 세척해야합니다.
기계적 세포 손상을 방지하기 위해 망막 외식편을 옮길 때 망막 신경 섬유층과 접촉하지 마십시오. 망막 외식편을 배양 삽입물로 원활하게 옮기기 위해 애완 동물을 망막 조직을 옮기기 전에 촉촉하게 유지하기 위해 미리 담글 수 있습니다. 또한 전체 공정은 공정 중 오염을 피하기 위해 스테로이드 분위기에서 수행되어야 합니다.
