Этот протокол описывает простой и эффективный метод дифференциации МПК человека в сложные трехмерные нейроорганоиды сетчатки для исследований и регенеративных применений. Этот метод включает в себя как адгезивые, так и суспензионные культуры, что позволяет селективно собирать и обогащать как органоиды сетчатки, так и клетки RP. Он может предложить жизнеспособную и регулярную поставку клеточных источников для разработки клеточной терапии дегенеративных заболеваний сетчатки.
Такие органоиды сетчатки, полученные из стволовых клеток, и клетки RPE полезны в качестве моделей in vitro для изучения развития глаз и наследственных заболеваний сетчатки. Этот метод может быть легко воспроизведен исследовательскими лабораториями, которые уже знакомы с работой с культурами IPSC человека. Визуальная демонстрация в значительной степени поддерживает идентификацию глазных полей и изоляцию нейросетчатых чашек на основе их пространственного положения и морфологических особенностей.
Для начала аспирируйте отработанную среду от 70 до 80% сливающихся культур человека IPSC в шестилуночные планшеты. Добавьте PBS в лунки, взболтайте их и отаспирируйте буфер для промывки. Затем добавьте один миллилитр раствора для диссоциации клеток или CDS в каждую лунку и инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти-семи минут, пока клетки не округлются.
Аспирируйте CDS и соберите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Вращайте трубку со скоростью 1 000 об/мин в течение четырех минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1,2 миллилитра среды Essential 8.
Дозируйте 200 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку шестилуночной пластины с матричным покрытием, содержащей 1,5 миллилитра питательной среды IPSC и 10 микромоляров Y27632. Через 12-24 часа удалите отработанную среду и добавьте предварительно подогретую среду для полного вознесения без Y27632 для поддержания культур. Меняйте культуральную среду каждые 24 часа, пока культуры не достигнут 70-80% слияния.
На нулевой день аспирируйте поддерживающую среду IPSC человека и добавьте индукционную среду дифференцировки, содержащую один нанограмм на миллилитр BFGF и один нанограмм на миллилитр Noggin, в шестилуночную пластину. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в 5%-ном инкубаторе углекислого газа. В первый день аспирируйте отработанную среду и добавьте индукционную среду дифференцировки, содержащую один нанограмм на миллилитр BFGF и 10 нанограмм на миллилитр Noggin.
Снова инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в 5%-ном инкубаторе углекислого газа. На второй и третий день удалите отработанную среду и добавьте индукционную среду дифференцировки, содержащую 10 нанограммов на миллилитр Noggin. После добавления двух миллилитров на лунку в шестилуночную пластину инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия в 5%-ном инкубаторе углекислого газа и меняйте среду каждые 24 часа.
На четвертый день удалите отработанную среду и добавьте среду для дифференцировки сетчатки или RDM. Выполните ту же процедуру, чтобы добавить два миллилитра на лунку в шестилуночную тарелку и инкубировать культуры. Меняйте носитель каждый день.
Примерно на 14-й и 18-й день наблюдайте культуры под микроскопом при 10-кратном увеличении на предмет появления нейронных розеточных доменов, состоящих из предшественников раннего глазного поля. Примерно на 21-й и 28-й день наблюдайте за культурами под микроскопом при 4-кратном и 10-кратном увеличении, чтобы наблюдать появление самоорганизующихся отчетливых EFP с центральным островком круговых 3D-структур нейросетчатки, окруженных смежными выростами нейроэпителия и эпителия поверхности глаза. Возьмите стерильную пипетку Пастера и держите основание в одной руке, а кончик капилляра в другой.
Пламя стерилизует и нагревает область около середины кончика капилляра вращательными движениями, пока стекло не станет податливым. Затем отойдите от пламени и быстро вытяните кончик капилляра наружу, чтобы создать тонкий кончик капилляра с закрытым просветом. Держите тонкий наконечник горизонтально перед пламенем и быстро пропустите его через пламя движением наружу, чтобы создать гладкий крючок или L-образный капиллярный наконечник.
Под стереомикроскопом вручную выберите хорошо сформированные чашки нейросетчатки из отдельных EFP, используя гладкую внешнюю зону кривизны капиллярного крючка в качестве мелкой ложки. На 25-й и 30-й дни добавьте четыре миллилитра предварительно подогретой среды для дифференцировки сетчатки в 60-миллиметровую чашку с низкой насадкой в культуру и поддерживайте чашки сетчатки для генерации 3D-органоидов сетчатки. Это должно быть сделано до сбора чашек нейросетчатки.
Установите микропипетку диаметром один миллиметр на аспирацию 100 микролитров и используйте микронаконечники объемом один миллилитр с широкими отверстиями для аспирации и переноса плавающих чашек сетчатки в свежие чашки для культур с низкой адгезией, приготовленные ранее. Сохраняйте чашки сетчатки в RDM в виде неадгезивных суспензионных культур и инкубируйте их при 37 градусах Цельсия в 5%-ном инкубаторе углекислого газа. На 30-й и 45-й день, следуя методу частичной подкормки, удалите половину объема отработанной среды и замените ее равным объемом свежей среды.
На 45-й и 60-й день культивируйте органоиды сетчатки в течение следующих двух недель в RDM, содержащем 100 микромолярных тауринов, для поддержки лучшей выживаемости и дифференцировки линий нейропредшественников сетчатки и развития зрелых типов клеток сетчатки. Органоиды сетчатки характеризуются на разных стадиях созревания для экспрессии нескольких маркеров-предшественников сетчатки с помощью ОТ-ПЦР и иммуногистохимии. Результаты ОТ-ПЦР подтвердили индукцию и экспрессию нейромаркеров сетчатки в органоидах сетчатки месячного возраста и двухмесячных органоидах сетчатки.
Здесь показаны конфокальные изображения иммуномеченных участков незрелых органоидов сетчатки, использующих антитела против нейромаркеров-предшественников сетчатки Chx10, PAX6 и Otx2, и зрелых органоидов сетчатки, использующих антитела против маркеров-предшественников фоторецепторов recoverin и CRX. Заметный внешний слой органоидов сетчатки с дифференцирующимися фоторецепторными клетками увеличен и показан на этих изображениях. Рудиментарные внутренние сегментообразные расширения отмечены белыми стрелками.
Кластеры EFP с нейросетчаткой в центре и мигрирующими выростами RPE показывают пигментацию вдоль передних краев. Здесь показаны хорошо дифференцированные пигментные эпителиальные выросты из нескольких EFP по всему нейро-островку сетчатки. Более высокое увеличение EFP показывает миграционную зону предшественников RPE и эпителий поверхности глаза, окружающий нейросетчатку.
Здесь показаны расширенные адгезивные культуры, в которых образовались монослои незрелых клеток RPE, содержащие как пигментированные, так и непигментированные клетки. Монослойные культуры полностью зрелых и пигментированных клеток RPE показывают морфологию булыжника на 60-й день. На этом рисунке показаны клетки RPE, экспрессирующие PAX6, MITF и RPE65.
Эти изображения представляют собой EFP с аномальными агрегатами предшественников сетчатки с искаженным слоистым слоением и отсутствием бороздки. На этом рисунке показан EFP с миниатюрной нейросетчатой чашечкой, но без окружающей зоны RPE и эпителия поверхности глаза. На репрезентативном изображении показаны нерегулярные нейроретинальные агрегаты, сформированные в культуре суспензии.
Очень важно начать процесс дифференцировки с использованием близко сливающихся растущих культур МПК для достижения эффективной индукции глазных полей в течение трех-четырех недель. Органоиды сетчатки и клетки RPE, полученные из нормальных и специфических для пациента IPC, могут быть использованы в качестве моделей заболеваний сетчатки и для тестирования новых терапевтических препаратов.
