Наш протокол представляет собой метод in vivo для исследования клеточно-автономных функций FMRP во время разработки. Это может помочь понять специфическую для типа клетки патофизиологию синдрома хрупкой Х. Этот метод использует стадийную, участковую и направленно-специфическую электропорацию лекарственно-индуцируемой векторной системы, содержащей небольшую РНК Шпильки Fmr1.
С помощью этого метода мы достигаем селективного нокдауна FMRP в слуховом контуре. Этот метод также может быть применен для исследования функции других генов в слуховом контуре или вестибулярной системе. Начните с размещения яиц горизонтально, чтобы расположить эмбрион на верхней части яйца для легкой манипуляции.
Инкубируют при 38 градусах Цельсия в течение 46-48 часов до Гамбургера и Гамильтона, или стадии HH 12, для трансфекции нервной трубки или в течение 54-56 часов до HH 13 для трансфекции отоцисты. Извлекайте яйца из инкубатора, по дюжине яиц за раз. Удержание яиц вне инкубатора в течение более одного часа приводит к изменениям в развитии и снижает жизнеспособность.
Используйте фонарик, чтобы бросить свет со дна яйца. Расположение эмбриона выглядит как темная область на яичной скорлупе. Отметьте расположение эмбриона на яичной скорлупе карандашом.
Протрите яйца марлей, содержащей 75% этанола, и просверлите отверстие в заостренном конце яиц кончиком ножниц. Затем удалите два миллилитра альбумина с помощью игольчатого шприца 18-го калибра. Убедитесь, что отверстие достаточно большое, чтобы можно было вставить иглу.
Протрите любой протекающий альбумин марлей и заклейте отверстие прозрачной лентой. Накройте верхнюю часть яиц прозрачной лентой, центрируясь на темной области, отмеченной карандашом, чтобы свести к минимуму трещины и предотвратить падение мусора скорлупы во время окна. Протрите все хирургические инструменты марлей, содержащей 75% этанола, и протрите покрытую лентой область 75% этанолом.
Используйте небольшую пару ножниц, чтобы вырезать окно площадью от одного до двух квадратных сантиметров по окружности карандашной метки. Держите ножницы плоскими, чтобы не повредить эмбрион под ними. Поместите оконное яйцо под стереомикроскоп с 10-кратным окуляром и 2-кратным зумом.
Наполните одномиллилитровой шприц раствором чернил, а затем поместите иглу 27-го калибра. Согните иглу под углом 45 градусов щипцами. Под микроскопом осторожно ткните от края области опакувы и вставьте иглу под эмбрион.
Введите около 50 микролитров чернил, которые будут диффундировать ниже области пеллюцида, для визуализации эмбриона. Чернила образуют темный фон для четкой визуализации эмбриона. Втяните стеклянные капилляры в пипетки с помощью съемника пипетки.
Под рассекающим микроскопом осторожно откройте кончик капиллярной иглы до 10 – 20 микрометров в диаметре с помощью щипцов. Храните пипетки в ящике для хранения до использования. Затем заполните капиллярную пипетку 0,5-1 микролитром плазмидной смеси, применяя отрицательное давление через резиновую трубку на конце пипетки шприцем.
Поместите яйцеклетку под микроскоп так, чтобы эмбрион был вертикально ориентирован с хвостом рядом с вами. Держите капиллярную пипетку одной рукой или трехосевым манипулятором и приведите кончик пипетки к ромбомеру от 5 до 6. в направлении «хвост к голове».
Осторожно просуните наконечник через вителлиновую мембрану в дорсальную нервную трубку, а затем немного выньте пипетку, чтобы кончик находился в просвете нервной трубки. Вводят плазмидную смесь, применяя давление воздуха до тех пор, пока тонированная плазмида полностью не диффундирует в ромбомер 5-6 и не распространится на ромбомер 3 и ромбомер 4. Проверьте успешную инъекцию, которая достигается, когда раствор синей плазмиды быстро диффундирует вниз по нервной трубке без утечки.
Когда происходит утечка, синий быстро исчезает. Сразу после инъекции поместите платиновый биполярный электрод по обе стороны нервной трубки. Подайте два импульса длительностью 12 вольт и продолжительностью 50 миллисекунд с помощью электропоратора.
Наблюдайте пузырьки воздуха на концах биполярного электрода, с большим количеством на отрицательной стороне. Проверьте успешную электропорацию, которая достигается, когда тонированная плазмидная смесь попадает в ткань нервной трубки вблизи положительной стороны электрода. После электропорации осторожно извлеките биполярный электрод.
Накройте окно на яичной скорлупе куском прозрачной пленки, предварительно нарезанной на двухдюймовые квадраты и опрысканной 75% этанолом. Поместите яйцо обратно в инкубатор. Очистите биполярный электрод, подав от 10 до 20 импульсов продолжительностью 12 вольт и 50 миллисекунд в физиологическом растворе, прежде чем перейти к следующему яйцу.
Под микроскоп поместите яйцеклетку таким образом, чтобы эмбрион находился вертикально с хвостом рядом с вами. Держите капиллярную пипетку и аккуратно ткните правой отоцистой в дорсолатеральном направлении. Вводят плазмидную смесь давлением воздуха до тех пор, пока отоциста не наполнится синим раствором.
Проверьте успешную инъекцию, которая достигается, когда синяя плазмидная смесь ограничена отоцистой и не протекает. Сразу после инъекции поместите биполярный электрод на отоцисту и расположите положительную и отрицательную стороны спереди и сзади к отоцисте соответственно. Подайте два импульса длительностью 12 вольт и продолжительностью 50 миллисекунд с помощью электропоратора.
Проверьте успешность электропорации, которая достигается, когда смешение синей плазмиды попадает в ткань отоцисты вблизи положительной стороны электрода. После электропорации аккуратно снимите биполярный электрод и накройте окно на яичной скорлупе прозрачной пленкой. Наконец, верните яйцо в инкубатор.
Репрезентативное изображение показывает пример эмбрионального третьего дня, или E3, после трансфекции нейротрубки и лечения доксом на эмбриональный день два, или E2. Трансфектированные клетки с fmr1 шРНК и EGFP на поперечном сечении показаны здесь. EGFP-экспрессирующие клетки были ограничены одной стороной нервной трубки и стволом мозга. Поперечное сечение на E15 с EGFP-экспрессирующим ядром magnocellularis, или NM-нейронами, на трансфектированной стороне показано здесь.
На контралатеральной стороне EGFP-содержащие аксоны были замечены в вентральной части ядра laminaris, или NL. Эффект нокдауна шРНК Fmr1 был подтвержден выраженным снижением иммунореактивности FMRP в трансфектированных нейронах NM по сравнению с соседними нетрансфектированными нейронами. Слуховой ганглий на E19 с иммунореактивностью FMRP показан здесь. Слуховые ганглиозные нейроны не были трансфектированы.
Некоторые глиальные клетки, полученные из клеток черепного нервного гребня, были трансфектированы. Репрезентативные изображения показывают нокдаун FMRP в слуховом протоке после трансфекции отоциста. Слуховые протоки на E9 демонстрировали обширную флуоресценцию EGFP.
На поперечных срезах EGFP-экспрессирующие клетки располагались в базилярном сосочке и слуховом ганглии. Эффект нокдауна ШРНК Fmr1 был подтвержден снижением иммунореактивности FMRP в трансфектированных волосковых клетках по сравнению с соседними нетрансфектными волосковыми клетками. Аналогичным образом, иммунореактивность FMRP была в значительной степени снижена в трансфектированных слуховых ганглиозных нейронах.
Центральная проекция трансфектированных слуховых ганглиозных нейронов отслеживалась до ствола мозга через слуховой нерв с характерными концевыми окончаниями. При попытке этой процедуры самым важным является контроль места и направления электропорации для селективной трансфекции. После этой процедуры может быть выполнено заполнение одного типа клеток, иммуноокрашивание, сортировка клеток с последующим массовым спектром или секвенирование одиночных клеток для выявления изменений на морфологическом и биохимическом уровнях.
Этот метод также позволяет селективно редактировать другие гены с временным контролем и специфичностью компонентов в слуховом ухе для стволовых цепей и может быть модифицирован для манипулирования вестибулярной системой.
