بروتوكولنا هو طريقة في الجسم الحي للتحقيق في وظائف الخلية المستقلة ل FMRP أثناء التطوير. يمكن أن يساعد ذلك في فهم الفيزيولوجيا المرضية الخاصة بنوع الخلية لمتلازمة X الهشة. تستخدم هذه الطريقة التثقيب الكهربائي الخاص بالمرحلة والموقع والاتجاه لنظام ناقل مستحث للدواء يحتوي على الحمض النووي الريبي الصغير Fmr1.
بهذه الطريقة ، نحقق ضربة قاضية FMRP الانتقائية في الدائرة السمعية. يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة لدراسة وظيفة الجينات الأخرى في الدائرة السمعية أو الجهاز الدهليزي. ابدأ بوضع البويضات أفقيا لوضع الجنين على قمة البويضة لسهولة التلاعب بها.
احتضن عند 38 درجة مئوية لمدة 46 إلى 48 ساعة حتى هامبرغر وهاملتون ، أو HH المرحلة 12 ، لنقل الأنبوب العصبي أو لمدة 54 إلى 56 ساعة حتى HH 13 لنقل كيس الأذن. إزالة البيض من الحاضنة ، دزينة من البيض في وقت واحد. يؤدي إبقاء البيض خارج حاضنته لأكثر من ساعة إلى حدوث اختلافات في النمو ويقلل من قابليته للحياة.
استخدم مصباحا يدويا لإلقاء الضوء من قاع البيضة. يظهر موقع الجنين كمنطقة مظلمة على قشر البيض. بمناسبة موقع الجنين على قشر البيض بقلم رصاص.
امسح البيض بشاش يحتوي على 75٪ إيثانول وحفر حفرة في الطرف المدبب للبيض باستخدام طرف المقص. بعد ذلك ، قم بإزالة ملليلتر من الألبومين باستخدام حقنة إبرة قياس 18. تأكد من أن الفتحة كبيرة بما يكفي للسماح بإدخال الإبرة.
امسح أي ألبومين متسرب بالشاش وأغلق الفتحة بشريط شفاف. قم بتغطية الجزء العلوي من البيض بشريط شفاف ، مع التركيز على المنطقة الداكنة التي تحمل علامة قلم رصاص لتقليل التشققات ومنع سقوط حطام القشرة أثناء النوافذ. امسح جميع أدوات الجراحة بشاش يحتوي على 75٪ إيثانول وامسح المنطقة المغطاة بالشريط بنسبة 75٪ إيثانول.
استخدم مقصا صغيرا لقص نافذة من سنتيمتر إلى سنتيمترين مربعين حول محيط علامة القلم الرصاص. امسك المقص بشكل مسطح لتجنب إتلاف الجنين تحته. ضع البيضة ذات النوافذ تحت مجهر مجسم مع قطعة عين 10X وتكبير 2X.
املأ حقنة سعة ملليلتر واحد بمحلول الحبر ثم قم بتركيب إبرة قياس 27. ثني الإبرة بزاوية 45 درجة بالملقط. تحت المجهر ، كزة بعناية من حافة المنطقة معتمة وأدخل الإبرة تحت الجنين.
حقن حوالي 50 ميكرولتر من الحبر ، والتي سوف تنتشر تحت المنطقة pellucida ، لتصور الجنين. سيشكل الحبر خلفية داكنة للتصور الواضح للجنين. اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية إلى ماصات باستخدام مجتذب ماصة.
تحت مجهر تشريح ، افتح بعناية طرف الإبرة الشعرية إلى قطرها من 10 إلى 20 ميكرومتر باستخدام ملقط. قم بتخزين الماصات في صندوق تخزين حتى الاستخدام. بعد ذلك ، املأ ماصة شعرية ب 0.5 إلى 1 ميكرولتر من خليط البلازميد عن طريق تطبيق ضغط سلبي من خلال أنبوب مطاطي في نهاية الماصة باستخدام حقنة.
ضع البويضة تحت المجهر بحيث يكون الجنين موجها رأسيا مع الذيل بالقرب منك. امسك الماصة الشعرية بيد واحدة أو باستخدام مناور ثلاثي المحاور وادفع طرف الماصة إلى المعين من 5 إلى 6. في اتجاه الذيل إلى الرأس.
قم بوخز الطرف برفق عبر غشاء vitellin إلى الأنبوب العصبي الظهري ، ثم اسحب الماصة قليلا بحيث يكون الطرف في تجويف الأنبوب العصبي. حقن خليط البلازميد عن طريق الضغط على الهواء حتى ينتشر البلازميد الملون بالكامل في المعين 5 إلى 6 ويمتد إلى المعين 3 والمعين 4. تحقق من نجاح الحقن ، والذي يتحقق عندما ينتشر محلول البلازميد الأزرق بسرعة أسفل الأنبوب العصبي دون تسرب.
عندما يحدث تسرب ، يتلاشى اللون الأزرق بسرعة. بعد الحقن مباشرة ، ضع قطبا كهربائيا ثنائي القطب من البلاتين على جانبي الأنبوب العصبي. قم بتوصيل نبضتين بجهد 12 فولت ومدة 50 مللي ثانية باستخدام جهاز كهربائي.
راقب فقاعات الهواء في نهايات القطب ثنائي القطب ، مع وجود المزيد على الجانب السلبي. تحقق من التثقيب الكهربائي الناجح ، والذي يتحقق عندما يدخل خليط البلازميد الملون إلى نسيج الأنبوب العصبي بالقرب من الجانب الإيجابي للقطب الكهربائي. بعد التثقيب الكهربائي ، قم بإزالة القطب ثنائي القطب بعناية.
قم بتغطية النافذة الموجودة على قشر البيض بقطعة من الفيلم الشفاف المقطوع مسبقا إلى مربعات بحجم بوصتين ورشها بنسبة 75٪ من الإيثانول. ضع البيضة مرة أخرى في حاضنتها. نظف القطب ثنائي القطب عن طريق توصيل 10 إلى 20 نبضة من 12 فولت ومدة 50 مللي ثانية في محلول ملحي قبل الانتقال إلى البويضة التالية.
تحت المجهر ، ضع البويضة بطريقة تجعل الجنين عموديا مع الذيل بالقرب منك. امسك الماصة الشعرية وكزة كيس الأذن الأيمن برفق في الاتجاه الظهري الجانبي. حقن خليط البلازميد بضغط الهواء حتى تمتلئ كيس الأذن بمحلول أزرق.
تحقق من نجاح الحقن، والذي يتحقق عندما يكون خليط البلازميد الأزرق محصورا داخل الكيسة الأذنية ولا يتسرب. مباشرة بعد الحقن ، ضع القطب ثنائي القطب على كيس الأذن وضع الجانبين الإيجابي والسلبي الأمامي والخلفي للكيس الأذني ، على التوالي. قم بتوصيل نبضتين بجهد 12 فولت ومدة 50 مللي ثانية باستخدام جهاز التثقيب الكهربائي.
تحقق من التثقيب الكهربائي الناجح ، والذي يتحقق عندما يدخل خليط البلازميد الأزرق إلى أنسجة كيس الأذن بالقرب من الجانب الإيجابي للقطب الكهربائي. بعد التثقيب الكهربائي ، قم بإزالة القطب ثنائي القطب بعناية وقم بتغطية النافذة على قشر البيض بفيلم شفاف. أخيرا ، أعد البويضة إلى الحاضنة.
توضح الصورة التمثيلية مثالا لليوم الجنيني الثالث، أو E3، بعد نقل الأنبوب العصبي وعلاج دوكس في اليوم الجنيني الثاني، أو E2. تظهر هنا الخلايا المنقولة باستخدام Fmr1 shRNA و EGFP على المقطع العرضي. اقتصرت الخلايا المعبرة عن EGFP على جانب واحد من الأنبوب العصبي وجذع الدماغ. يظهر هنا مقطع عرضي عند E15 مع نواة ماغنوسيلواريسية معبرة عن EGFP، أو الخلايا العصبية NM، على الجانب المنقول.
على الجانب المقابل، شوهدت محاور عصبية تحتوي على EGFP في الجزء البطني من النواة الصفيحية، أو NL. تم التحقق من صحة تأثير ضربة قاضية ل Fmr1 shRNA من خلال تخفيضات ملحوظة في النشاط المناعي FMRP في الخلايا العصبية NM المنقولة مقارنة بالخلايا العصبية المجاورة غير المنقولة. تظهر هنا العقدة السمعية في E19 مع النشاط المناعي FMRP. لم يتم نقل الخلايا العصبية العقدية السمعية.
تم نقل بعض الخلايا الدبقية المشتقة من خلايا القمة العصبية القحفية. تظهر الصور التمثيلية ضربة قاضية FMRP في القناة السمعية بعد نقل كيس الأذن. أظهرت القنوات السمعية في E9 مضان EGFP واسع النطاق.
في المقاطع المستعرضة ، كانت الخلايا المعبرة عن EGFP موجودة في الحليمة القاعدية والعقدة السمعية. تم التحقق من صحة تأثير ضربة قاضية ل Fmr1 shRNA من خلال انخفاض النشاط المناعي FMRP في خلايا الشعر المنقولة مقارنة بخلايا الشعر المجاورة غير المنقولة. وبالمثل ، تضاءل النشاط المناعي FMRP إلى حد كبير في الخلايا العصبية العقدية السمعية المنقولة.
تم تتبع الإسقاط المركزي للخلايا العصبية العقدية السمعية المنقولة إلى جذع الدماغ عبر العصب السمعي مع أطراف المصباح المميز. أثناء محاولة هذا الإجراء ، فإن أهم شيء هو التحكم في موقع واتجاه التثقيب الكهربائي للنقل الانتقائي. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء ملء نوع الخلية الواحدة ، أو التلوين المناعي ، أو فرز الخلايا متبوعا بطيف الكتلة ، أو تسلسل الخلية الواحدة للكشف عن التغييرات على المستويات المورفولوجية والكيميائية الحيوية.
تتيح هذه التقنية أيضا التحرير الانتقائي للجينات الأخرى مع التحكم الزمني وخصوصية المكونات في الأذن السمعية للدوائر الجذعية ويمكن تعديلها للتعامل مع النظام الدهليزي.
