Protokolümüz, geliştirme sırasında FMRP'nin hücre otonom fonksiyonlarını araştırmak için in vivo bir yöntemdir. Bu, kırılgan X sendromunun hücre tipine özgü patofizyolojisini anlamaya yardımcı olabilir. Bu yöntem, Fmr1 küçük saç tokası RNA'sı içeren ilaca bağlı bir vektör sisteminin evre, bölge ve yöne özgü elektroporasyonunu kullanır.
Bu yöntemle, işitsel devrede seçici FMRP knockdown'ı elde ediyoruz. Bu yöntem, işitsel devredeki veya vestibüler sistemdeki diğer genlerin işlevini araştırmak için de uygulanabilir. Kolay manipülasyon için embriyoyu yumurtanın üstüne yerleştirmek için yumurtaları yatay olarak yerleştirerek başlayın.
Nöral tüp transfeksiyonu için Hamburger ve Hamilton'a kadar 46 ila 48 saat veya HH evre 12'ye kadar 38 santigrat derecede veya otokist transfeksiyonu için HH 13'e kadar 54 ila 56 saat boyunca inkübe edin. Yumurtaları inkübatörden, bir seferde bir düzine yumurtadan çıkarın. Yumurtaları kuluçka makinesinden bir saatten fazla uzak tutmak, gelişimsel varyasyonlara neden olur ve canlılığı azaltır.
Yumurtanın altından ışık yaymak için bir el feneri kullanın. Embriyonun yeri yumurta kabuğu üzerinde karanlık bir alan olarak görünür. Embriyonun yumurta kabuğu üzerindeki yerini bir kalemle işaretleyin.
Yumurtaları% 75 etanol içeren gazlı bezle silin ve makas ucunu kullanarak yumurtaların sivri ucunda bir delik açın. Ardından, 18 gauge iğneli bir şırınga ile iki mililitre albümin çıkarın. Deliğin yalnızca iğne yerleştirmeye izin verecek kadar büyük olduğundan emin olun.
Sızdıran albüminleri gazlı bezle silin ve deliği şeffaf bantla kapatın. Çatlakları en aza indirmek ve pencereleme sırasında düşen kabuk kalıntılarını önlemek için kalemle işaretlenmiş karanlık alana ortalayarak yumurtaların üstünü şeffaf bir bantla örtün. Tüm ameliyat aletlerini %75 etanol içeren gazlı bezle silin ve bantla kaplı bölgeyi %75 etanol ile silin.
Kalem işaretinin çevresi etrafında bir ila iki santimetrekarelik bir pencereyi kesmek için küçük bir makas kullanın. Alttaki embriyoya zarar vermemek için makası düz tutun. Pencereli yumurtayı 10X göz merceği ve 2X zoom ile bir stereomikroskop altına yerleştirin.
Bir mililitrelik bir şırıngayı mürekkep çözeltisiyle doldurun ve ardından 27 gauge'lik bir iğne takın. İğneyi forseps ile 45 derecelik bir açıyla bükün. Mikroskop altında, opaqua alanının kenarından dikkatlice dürtün ve iğneyi embriyonun altına yerleştirin.
Embriyo görselleştirme için pellucida alanının altına yayılacak yaklaşık 50 mikrolitre mürekkep enjekte edin. Mürekkep, embriyonun net bir şekilde görselleştirilmesi için koyu bir arka plan oluşturacaktır. Bir pipet çektirici kullanarak cam kılcal damarları pipetlere çekin.
Diseksiyon yapan bir mikroskop altında, kılcal iğnenin ucunu forseps ile çapı 10 ila 20 mikrometreye dikkatlice açın. Pipetleri kullanana kadar bir saklama kutusunda saklayın. Daha sonra, pipetin ucundaki kauçuk bir tüpten bir şırınga ile negatif basınç uygulayarak bir kılcal pipeti 0,5 ila 1 mikrolitre plazmid karışımı ile doldurun.
Yumurtayı mikroskop altına yerleştirin, böylece embriyo size yakın kuyrukla dikey olarak yönlendirilir. Kılcal pipeti bir elinizle veya üç eksenli manipülatörle tutun ve pipetin ucunu eşkenar dörtgen 5 ila 6'ya doğru sürün. kuyruktan başa doğru.
Ucu vitellin zarından ve dorsal nöral tüpün içine yavaşça sokun ve ardından pipeti biraz çekin, böylece uç nöral tüpün lümeninde olur. Renkli plazmid eşkenar dörtgen 5 ila 6'ya tamamen yayılana ve eşkenar dörtgen 3 ve eşkenar dörtgen 4'e uzanana kadar hava basıncı uygulayarak plazmid karışımını enjekte edin. Mavi plazmid çözeltisi sızıntı yapmadan nöral tüpten hızla aşağı yayıldığında elde edilen başarılı enjeksiyonu kontrol edin.
Sızıntı meydana geldiğinde, mavi hızla kaybolur. Enjeksiyondan hemen sonra, nöral tüpün her iki tarafına bir platin bipolar elektrot yerleştirin. Bir elektroporatör ile 12 volt ve 50 milisaniye süreli iki darbe verin.
Bipolar elektrotun uçlarındaki hava kabarcıklarını, negatif tarafta daha fazlası ile gözlemleyin. Renkli plazmid karışımı elektrotun pozitif tarafına yakın nöral tüp dokusuna girdiğinde elde edilen başarılı elektroporasyonu kontrol edin. Elektroporasyondan sonra, bipolar elektrodu dikkatlice çıkarın.
Yumurta kabuğundaki pencereyi, iki inçlik karelere önceden kesilmiş ve% 75 etanol ile püskürtülen bir şeffaf film parçası ile örtün. Yumurtayı tekrar inkübatörüne yerleştirin. Bir sonraki yumurtaya geçmeden önce 12 voltluk 10 ila 20 darbe ve tuzlu suda 50 milisaniye süre vererek bipolar elektrodu temizleyin.
Mikroskop altında, yumurtayı embriyo yakınınızdaki kuyrukla dikey olacak şekilde yerleştirin. Kılcal pipeti tutun ve sağ otokisti dorsolateral yönde hafifçe dürtün. Plazmid karışımını, otokist mavi çözelti ile doldurulana kadar hava basıncı ile enjekte edin.
Mavi plazmid karışımı otokist içinde hapsedildiğinde ve sızıntı yapmadığında elde edilen başarılı bir enjeksiyon olup olmadığını kontrol edin. Enjeksiyondan hemen sonra, bipolar elektrodu otokist üzerine yerleştirin ve pozitif ve negatif tarafları sırasıyla otokistin ön ve arka taraflarına yerleştirin. Elektroporatör ile 12 volt ve 50 milisaniye süreli iki darbe verin.
Mavi plazmid karışımı elektrotun pozitif tarafına yakın otokistin dokusuna girdiğinde elde edilen başarılı elektroporasyonu kontrol edin. Elektroporasyondan sonra, bipolar elektrodu dikkatlice çıkarın ve yumurta kabuğundaki pencereyi şeffaf bir filmle örtün. Son olarak, yumurtayı inkübatöre geri verin.
Temsili görüntü, embriyonik ikinci günde veya E2'de nöro tüp transfeksiyonu ve doks tedavisini takiben embriyonik üçüncü gün veya E3'ün bir örneğini göstermektedir. Enine kesitte Fmr1 shRNA ve EGFP bulunan transfekte hücreler burada gösterilmiştir. EGFP eksprese eden hücreler, nöral tüpün ve beyin sapının bir tarafı ile sınırlıydı. E15'te, transfekte edilen tarafta EGFP eksprese eden çekirdek magnoselülaris veya NM nöronları ile bir kesit burada gösterilmiştir.
Kontralateral tarafta, çekirdek laminarisin ventral kısmında veya NL'de EGFP içeren aksonlar görüldü. Fmr1 shRNA'nın nakavt etkisi, transfekte NM nöronlarında FMRP immünoreaktivitesinde, komşu transfekte olmayan nöronlara kıyasla belirgin azalmalarla doğrulandı. FMRP immünoreaktivitesi olan E19'daki işitsel ganglion burada gösterilmiştir. İşitsel ganglion nöronları transfekte edilmedi.
Kraniyal nöral krest hücrelerinden türetilen bazı glial hücreler transfekte edildi. Temsili görüntüler, otokist transfeksiyonunu takiben işitme kanalında FMRP knock-down'u göstermektedir. E9'daki işitme kanalları geniş EGFP floresansı sergiledi.
Enine kesitlerde, EGFP eksprese eden hücreler baziler papillada ve işitsel ganglionda yerleşti. Fmr1 shRNA'nın knockdown etkisi, transfekte saç hücrelerinde komşu transfekte olmayan saç hücrelerine kıyasla azalmış FMRP immünoreaktivitesi ile doğrulanmıştır. Benzer şekilde, FMRP immünoreaktivitesi transfekte işitsel ganglion nöronlarında büyük ölçüde azalmıştır.
Transfekte işitsel ganglion nöronlarının merkezi projeksiyonu, karakteristik uç ampul terminalleri ile işitme siniri aracılığıyla beyin sapına izlendi. Bu prosedürü denerken en önemli şey, seçici transfeksiyon için elektroporasyonun yerini ve yönünü kontrol etmektir. Bu prosedürü takiben, morfolojik ve biyokimyasal düzeylerdeki değişiklikleri ortaya çıkarmak için tek hücre tipi dolgu, immün boyama, kütle spektrumu ile takip edilen hücre sıralama veya tek hücre dizilimi yapılabilir.
Bu teknik aynı zamanda kök devreleri için işitsel kulakta zamansal kontrol ve bileşen özgüllüğü ile diğer genlerin seçici olarak düzenlenmesini sağlar ve vestibüler sistemi manipüle etmek için değiştirilebilir.
