Nuestro protocolo es un método in vivo para investigar las funciones autónomas celulares de FMRP durante el desarrollo. Esto puede ayudar a comprender la fisiopatología específica del tipo de célula del síndrome X frágil. Este método emplea electroporación específica de etapa, sitio y dirección de un sistema vectorial inducible por fármaco que contiene ARN horquilla pequeño Fmr1.
Con este método, conseguimos el knockdown selectivo de FMRP en el circuito auditivo. Este método también se puede aplicar para investigar la función de otros genes en el circuito auditivo o el sistema vestibular. Comience colocando los huevos horizontalmente para colocar el embrión en la parte superior del huevo para facilitar la manipulación.
Incubar a 38 grados centígrados durante 46 a 48 horas hasta Hamburger y Hamilton, o HH etapa 12, para la transfección del tubo neural o durante 54 a 56 horas hasta HH 13 para la transfección de otocisto. Retire los huevos de la incubadora, una docena de huevos a la vez. Mantener los huevos fuera de su incubadora durante más de una hora introduce variaciones en el desarrollo y reduce la viabilidad.
Use una linterna para proyectar luz desde el fondo del huevo. La ubicación del embrión aparece como un área oscura en la cáscara del huevo. Marque la ubicación del embrión en la cáscara del huevo con un lápiz.
Limpie los huevos con una gasa que contenga 75% de etanol y perfore un agujero en el extremo puntiagudo de los huevos con la punta de las tijeras. Luego, retire dos mililitros de albúmina con una jeringa de aguja de calibre 18. Asegúrese de que el orificio solo sea lo suficientemente grande como para permitir la inserción de la aguja.
Limpie cualquier albúmina que gotee con una gasa y selle el orificio con cinta adhesiva transparente. Cubra la parte superior de los huevos con cinta adhesiva transparente, centrándose en el área oscura marcada con lápiz para minimizar las grietas y evitar la caída de restos de cáscara durante la ventana. Limpie todas las herramientas de cirugía con una gasa que contenga 75% de etanol y limpie el área cubierta con cinta adhesiva con 75% de etanol.
Use un par pequeño de tijeras para cortar una ventana de uno o dos centímetros cuadrados alrededor de la circunferencia de la marca del lápiz. Sostenga las tijeras planas para evitar dañar el embrión debajo. Coloque el huevo con ventana bajo un microscopio estereoscópico con un ocular de 10X y un zoom de 2X.
Llene una jeringa de un mililitro con la solución de tinta y luego coloque una aguja de calibre 27. Doble la aguja en un ángulo de 45 grados con fórceps. Bajo el microscopio, asomar cuidadosamente desde el borde del área opaqua e insertar la aguja debajo del embrión.
Inyecte alrededor de 50 microlitros de tinta, que se difundirán por debajo del área pelúcida, para la visualización del embrión. La tinta formará un fondo oscuro para la visualización clara del embrión. Tire de los capilares de vidrio en pipetas con un extractor de pipetas.
Bajo un microscopio de disección, abra cuidadosamente la punta de la aguja capilar a 10 a 20 micrómetros de diámetro con fórceps. Guarde las pipetas en una caja de almacenamiento hasta su uso. A continuación, llene una pipeta capilar con 0,5 a 1 microlitros de la mezcla de plásmidos aplicando presión negativa a través de un tubo de goma en el extremo de la pipeta con una jeringa.
Coloque el huevo bajo el microscopio para que el embrión esté orientado verticalmente con la cola cerca de usted. Sujete la pipeta capilar con una mano o con el manipulador de tres ejes y conduzca la punta de la pipeta hacia el rombomero 5 a 6. en una dirección de cola a cabeza.
Empuje suavemente la punta a través de la membrana de vitellina y en el tubo neural dorsal, y luego retire la pipeta un poco para que la punta quede en el lumen del tubo neural. Inyecte la mezcla de plásmidos aplicando presión de aire hasta que el plásmido teñido se difunda completamente en el rombomero 5 a 6 y se extienda en el rombomero 3 y el rombomero 4. Verifique si la inyección es exitosa, lo que se logra cuando la solución de plásmido azul se difunde rápidamente por el tubo neural sin fugas.
Cuando se produce una fuga, el azul se desvanece rápidamente. Inmediatamente después de la inyección, coloque un electrodo bipolar de platino a cada lado del tubo neural. Suministre dos pulsos de 12 voltios y 50 milisegundos de duración con un electroporador.
Observe burbujas de aire en los extremos del electrodo bipolar, con más en el lado negativo. Verifique la electroporación exitosa, que se logra cuando la mezcla de plásmidos teñidos ingresa al tejido del tubo neural cerca del lado positivo del electrodo. Después de la electroporación, retire con cuidado el electrodo bipolar.
Cubra la ventana sobre la cáscara del huevo con un trozo de película transparente precortada en cuadrados de dos pulgadas y rociada con etanol al 75%. Vuelva a colocar el huevo en su incubadora. Limpie el electrodo bipolar administrando de 10 a 20 pulsos de 12 voltios y 50 milisegundos de duración en solución salina antes de proceder al siguiente huevo.
Bajo el microscopio, coloque el huevo de tal manera que el embrión esté vertical con la cola cerca de usted. Sostenga la pipeta capilar y empuje suavemente el otocisto derecho en dirección dorsolateral. Inyecte la mezcla de plásmidos con presión de aire hasta que el otocisto se llene con solución azul.
Verifique si hay una inyección exitosa, que se logra cuando la mezcla de plásmido azul está confinada dentro del otocisto y no tiene fugas. Inmediatamente después de la inyección, coloque el electrodo bipolar en el otocisto y coloque los lados positivo y negativo anterior y posterior al otocisto, respectivamente. Entrega dos pulsos de 12 voltios y 50 milisegundos de duración con el electroporador.
Verifique la electroporación exitosa, que se logra cuando la mezcla de plásmidos azules ingresa al tejido del otocisto cerca del lado positivo del electrodo. Después de la electroporación, retire con cuidado el electrodo bipolar y cubra la ventana con la cáscara del huevo con una película transparente. Finalmente, devuelva el huevo a la incubadora.
La imagen representativa muestra un ejemplo del tercer día embrionario, o E3, después de la transfección de neurotubos y el tratamiento con dox en el segundo día embrionario, o E2. Aquí se muestran las células transfectadas con Fmr1 shRNA y EGFP en la sección transversal. Las células que expresan EGFP estaban confinadas a un lado del tubo neural y el tronco encefálico. Aquí se muestra una sección transversal en E15 con el núcleo magnocelular que expresa EGFP, o neuronas NM, en el lado transfectado.
En el lado contralateral, se observaron axones que contienen EGFP en la porción ventral del núcleo laminaris, o NL. El efecto de knockdown del shRNA Fmr1 fue validado por marcadas reducciones en la inmunorreactividad FMRP en neuronas NM transfectadas en comparación con las neuronas vecinas no transfectadas. El ganglio auditivo en E19 con inmunorreactividad FMRP se muestra aquí. Las neuronas ganglionares auditivas no fueron transfectadas.
Algunas células gliales derivadas de las células de la cresta neural craneal fueron transfectadas. Las imágenes representativas muestran el derribo de FMRP en el conducto auditivo después de la transfección de otocistos. Los conductos auditivos en E9 exhibieron fluorescencia EGFP extensa.
En las secciones transversales, las células que expresan EGFP se localizaron en la papila basilar y el ganglio auditivo. El efecto de derribo del shRNA Fmr1 fue validado por la reducción de la inmunorreactividad FMRP en las células ciliadas transfectadas en comparación con las células ciliadas vecinas no transfectadas. Del mismo modo, la inmunorreactividad FMRP disminuyó en gran medida en las neuronas ganglionares auditivas transfectadas.
La proyección central de las neuronas ganglionares auditivas transfectadas se rastreó hasta el tronco encefálico a través del nervio auditivo con terminales terminales terminales caracterizadas. Al intentar este procedimiento, lo más importante es controlar el sitio y la dirección de la electroporación para la transfección selectiva. Después de este procedimiento, se puede realizar el llenado de tipo de célula única, la inmunotinción, la clasificación celular seguida de espectro de masas o la secuenciación de una sola célula para revelar los cambios a nivel morfológico y bioquímico.
Esta técnica también permite la edición selectiva de otros genes con control temporal y especificidad de componentes en el oído auditivo para circuitos madre y puede modificarse para manipular el sistema vestibular.
