Этот протокол позволяет исследователям определять сродство связывания аптамеров с мишенями, свободными в растворе, обеспечивая при этом понимание механизма связывания. Поскольку ITC измеряет изменения тепла из-за связывания, ни аптамер, ни лиганд не должны быть маркированы или функционализированы, как это было бы в случае с такими методами, как SPR. Новые пользователи должны обратить пристальное внимание на сопоставление буферов во всех компонентах привязки.
Кроме того, имейте в виду, что метод имеет высокие требования к образцам, которые может быть трудно удовлетворить для более крупных лигандов, таких как белки. Для начала активируют мембрану диализной колонны, заполняют буфером PBS, уравновешивают в течение 10 минут при комнатной температуре и центрифугу в 5 000 раз g в течение 15 минут. Снимите буфер и загрузите в колонну 500 микролитров образцов аптамера.
Центрифуга при 5 000 G и повторите ее четыре раза, чтобы обменять исходный буфер на PBS. Соберите диализированный АПТАМЕР ДНК с помощью пипетки и перенесите его в новую 1,5-миллилитровую трубку. Соберите последний проточный буфер для растворения тетрациклина.
Убедитесь, что буфер для эксперимента в шприце соответствует буферу в ячейке ссылки. Снова определите концентрацию аптамера с помощью УФ-видимого спектрометра. Используйте последний обменный буфер для регулировки концентрации до 40-микромолярного тетрациклина и двухмикролярного аптамера.
Сложите ДНК-аптамер, нагревая при 90 градусах Цельсия в течение 10 минут, охлаждая при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут, а затем возвращаясь к комнатной температуре в течение 20 минут. Дегазировать сложенный аптамер и диализованный тетрациклин с помощью станции дегазации или вакуумного насоса в течение 25 минут для устранения растворенных газов. После очистки и подтверждения чистоты машины, проверьте точность машины со стандартным комплектом, который включает ЭДТА и хлорид кальция, используя программу по умолчанию и следуя инструкциям производителя.
Настройте параметры выполнения. Проверьте необходимые тома с помощью работающего калькулятора программ. С помощью этого параметра выполнения измерения ITC с помощью 230 микролитров 40-микромолярного тетрациклина в шприце ITC и 485 микролитров двухмикролярного аптамера в образце ячейки ITC с использованием ITC.
Загрузите диализированные тетрациклиновые пластины шприца и сложенный аптамер в клетку образца, избегая пузырьков, используя пипетку. Запустите инструмент ITC, нажав кнопку Пуск на программном обеспечении. Откройте программное обеспечение для анализа данных, дважды щелкнув, чтобы начать анализ данных.
Откройте путь к сохраненным необработанным данным, чтобы узнать тенденцию привязки. Откройте вкладку Моделирование и используйте различные модели привязки, чтобы найти наиболее подходящую для кривой данных. Затем программное обеспечение автоматически вычисляет термограмму ITC и различные термодинамические параметры, включая энтальпию, энтропию, свободную энергию, константу равновесного связывания и стехиометрию.
Соберите термодинамические параметры, определенные на основе данных и информации о модели подгонки. Создайте отчет, включающий изображения термограммы ITC и различные термодинамические параметры. Аптамер, выбранный Кимом и др., связывается с тетрациклином со сродством связывания константы диссоциации один равен 13 микромолярам, а константа диссоциации два равна 53 наномолярам.
Модель подгонки и стехиометрия от ITC отражают, что аптамер связывается с тетрациклином через соотношение связывания 2:1 с моделью последовательного связывания. Термодинамические параметры, определенные в результате измерений ITC для второго участка, показали, что энтальпия, преодолевающая относительно значительные энтропийные потери, приводит к сильному связыванию. Энтальпийное связывание с потерей энтропии связано с конформационными изменениями нуклеиновых кислот, которые, как сообщалось, являются поведением связывания между РНК и небольшой молекулой.
Аптамер и лиганд должны находиться в одном буфере. Аптамер должен быть повторно свернут, если он развился с повторным складыванием, а образцы должны быть дегазированы. Рассмотрение этих соображений гарантирует, что только взаимодействия аптамер-лиганд способствуют измеряемому сигналу.
Из-за размера мишени аптамера подходящим последующим методом может быть микромасштабный термофорез для подтверждения измеренного сродства связывания в растворе.
