Использование ферментов в качестве катализаторов в реакциях может уменьшить количество энергии, необходимой для реакции, и уменьшить токсичные побочные продукты. Однако использование ферментов в промышленности ограничено, так как ферменты не стабильны и могут быть дорогими. Этот протокол может уменьшить количество времени, которое требуется, чтобы определить, являются ли условия вредными для активности ферментов, или если изменения в ферменте увеличили его стабильность.
Основным преимуществом этой техники является то, что она требует меньше человеко-часов, чем традиционные анализы стабильности ферментов. Кроме того, этот протокол может быть использован с широким спектром ферментов, потому что он может быть использован с любой реакцией, которая высвобождает или поглощает тепло. Для начала приготовьте буфер ацетата натрия 0,1 моляра.
Измерьте 800 миллилитров дистиллированной воды в стакане 1000 миллилитров. Затем взвесите 8,2 грамма ацетата ангидро натрия и добавьте его в стакан. Поместите стакан на тарелку для перемешивания.
Поместите стержень перемешать в стакан, и включите пластину перемешать, чтобы перемешать его до полного растворения. Когда ацетат ангидроса натрия полностью растворяется, используйте откалиброванный счетчик рН для измерения рН раствора. Используйте пипетку, чтобы добавить 1 молярной соляной кислоты или гидроксида натрия соответственно, чтобы получить желаемый рН на 4,6.
Добавьте дистиллированную воду в стакан до тех пор, пока общий объем не достигнет 1000 миллилитров. Чтобы подготовить ферментный раствор, в цилиндре с градуированным 15 миллилитом, измерьте 8 миллилитров буфера ацетата натрия 0,1. Затем добавьте буферный раствор в 15 миллилитровую коническую трубку с ферментом и энергично встряхните, пока фермент не растворился.
Добавьте больше буферного решения до тех пор, пока общий объем не достигнет 10 миллилитров. Храните ферментный раствор при 4 градусах цельсия до его использования. Чтобы подготовить субстратный раствор, взвесить субстрат и поместить его в стеклянный стакан весом 100 миллилитров.
Используйте градуированный цилиндр для измерения 20 миллилитров буферного раствора, а затем добавьте его в стеклянный стакан. Поместите стакан на тарелку для перемешивания и поместите магнитный стержень в стакан. Включите огонь и соответствующим образом отрегулируйте скорость перемешивания.
Разрешить перемешивание продолжать до тех пор, пока субстрат не растворится. Налейте раствор субстрата в 15 миллилитровую коническую трубку и добавьте ранее подготовленный буфер ацетата натрия, пока общий объем не составит 45 миллилитров. Встряхните трубку, чтобы перемешать.
Храните раствор субстрата при комнатной температуре до использования. На компьютере откройте установку ITC Run и нажмите кнопку. Нажмите скорость перемешивания, и установить до 350 об /мин.
Проверьте размер шприца на 50 микролитров. Установите температуру до 55 градусов по Цельсию и нажмите обновление. Подождите, по крайней мере один час, прежде чем приступить, чтобы дать достаточно времени для инструмента МТХ нагреваться или остыть по мере необходимости.
Перед загрузкой фермента убедитесь, что эталонная ячейка загружается с 350 микролитров дистиллированной воды. Чтобы очистить выборочную ячейку, заполните погрузочный шприц 500 микролитров 2-процентного раствора для очистки. Аккуратно вставьте иглу в образец клетки, заполните клетку и медленно удалите жидкость с помощью того же шприца.
Утилизировать жидкость в стакан. Повторите этот шаг дважды с 2 процентов очистки раствора, три раза с 70 процентов этанола, а затем мыть десять раз с дистиллированной водой. После очистки образцовой клетки заполните погрузочный шприц 450 микролитров ферментного раствора.
Аккуратно вставьте иглу вплоть до нижней части выборочных клеток и медленно прижимайте поршень к линии 100 микролитров, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха. Затем, мыть 50 микролитер титрование шприц с дистиллированной водой три раза, поместив кончик иглы в воду, чтобы медленно взять воду в шприц, а затем дозирования воды в контейнер для отходов. Промыть раствором субстрата три раза, чтобы удалить остаточную воду.
После этого заполните шприц с помощью субстрата раствором, натязав раствор до тех пор, пока шприц не будет полон без пузырьков воздуха. С помощью шприца еще в подложки раствор, удалить поршень, и позволяют примерно 2 микролитров воздуха, чтобы войти в верхней части шприца, и восстановить поршень. Снимите буретт ручку ITC, поместите шприц внутри ручки burette, и винт до жесткой.
Протрите кончик шприца с помощью ткани, свободной от ворса, а затем аккуратно поместите ручку буретты в прибор КИО и заблокив ее на месте. Для установки эксперимента выберите инкрементную титровацию. Нажмите вставку, чтобы настроить инъекции.
Отрегулируйте интервал инъекций до 5 400 секунд, объем инъекций до 4 микролитров и количество инъекций до четырех. Нажмите OK, чтобы подтвердить настройки. В эквилибрации поле, выберите авто equilibrate и большие ожидаемые нагревается.
Установите начальную базовую линию до 300 секунд. Чтобы начать запуск, нажмите на символ старта рядом с скоростью перемешивания, а затем нажмите на старт, который расположен рядом с символом гаечного ключа. Сохраните файл и позвольте инструменту работать.
Для анализа данных откройте файл в Nano Analyze. Нажмите на данные и выберите столбцы данных. Выберите все данные, скопируйте, а затем вставьте данные в Microsoft Excel.
Отрегулируйте 0 базовый уровень, добавив значение, необходимое на 300 секунд, чтобы сделать его 0. Примените эту коррекцию ко всему столбу значений скорости тепла. Затем графики сюжета минимальных или максимальных значений по отношению к времени, в которое произошло значение во время титрова.
В этом протоколе, данные ITC следы лактазы деятельности показано с четырьмя последовательными инъекциями лактозы в лактазный раствор в рН 4,6 буфера при 55 градусов по Цельсию, 45 градусов по Цельсию, 35 градусов по Цельсию, и 25 градусов по Цельсию. Без контроля ферментов было выполнено при температуре 55 градусов по Цельсию для нагрева смешивания. Для каждой инъекции фермента, есть начальное экзотермическое тепло смешивания, а затем, лактазы катализированный эндотермический гидролиз лактозы происходит до тех пор, пока реакция не будет завершена, и скорость тепла возвращается к исходной линии.
Эндотермический пиковый минимум после каждой инъекции, немного меньше, чем предыдущая инъекция из-за снижения энзиматической активности. Как и ожидалось, стабильность фермента для каждой инъекции уменьшается с повышением температуры. Контрольный эксперимент показывает, что активность лактазы при 25 градусах Цельсия снизилась на 8 процентов из-за разбавления после четырех инъекций.
Учитывая, что четвертая инъекция показывает 73-процентное снижение анализа, фактическая потеря активности ферментов составила 65 процентов. Таким образом, разбавление лактазы в результате каждой инъекции, было относительно небольшое влияние 11 процентов на активность ферментов. Важно, чтобы буфер, используемый для растворов фермента и субстрата, соответствовал как можно ближе.
Несоответствие рН или концентрации может привести к большему теплу смешивания, которое может замаскировать реакционной жары. Вы можете применить этот протокол для изучения ферментов и определить их стабильность путем измерения скорости тепла, выпущенного или поглощенного в ходе реакции.
