Этот протокол демонстрирует, что сочетание сенсорной транзакции матричной РНК с импедансными измерениями миграции и инвазии клеток в реальном времени облегчает идентификацию генов, стимулирующих миграцию и инвазию опухолевых клеток. Система анализа клеток на основе импеданса в режиме реального времени позволяет количественно, непрерывно и всесторонне отслеживать миграцию опухолевых клеток при изменении экспрессии генов. Гены, которые чрезмерно экспрессируют опухоли и стимулируют миграцию опухолевых клеток, могут быть идентифицированы как потенциальная мишень для ингибирования метастазирования в терапии рака.
Для начала добавьте 10 микролитров 10-кратного реакционного буфера, 1,5 микролитра PNE и 10 микрограммов плазмидной ДНК в микроцентрифужную пробирку для линеаризации плазмидной ДНК с помощью фермента рестрикции. Добавьте воду, не содержащую нуклеаз, чтобы довести объем реакции до 100 микролитров. Смешайте его, постукивая и вращая, прежде чем инкубировать реакционную смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи.
Снова открутите и добавьте пять микролитров 10% SDS и один микролитр 20 миллиграммов на миллилитр РНК-протеиназы K в реакционную смесь, прежде чем перемешать и открутить. После 30 минут инкубации при температуре 50 градусов Цельсия добавьте по два микролитра 10-кратного транскрипционного буфера, АТФ, ГТФ, УТФ, КТФ и Т7 и один микрограмм линеаризованной ДНК в микроцентрифужную пробирку для синтеза РНК-полимеразы Т7. Добавьте воду, не содержащую нуклеаз, чтобы довести объем реакции до 20 микролитров.
После отжима инкубируйте реакционную смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов для синтеза РНК. Затем открутите вниз и добавьте один микролитр ДНК и постучите до 15 минут инкубации при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы удалить шаблонную ДНК. Начните осаждение хлорида лития РНК, добавив в реакционную смесь 10 микролитров 7,5 молярного хлорида лития.
После постукивания и отжима реакционную смесь инкубируют при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение 30 минут. Для укупорки нагрейте образец РНК при температуре 65 градусов Цельсия в течение 10 минут, а затем поместите его на лед для охлаждения. Затем добавьте компоненты реакции укупорки и перемешайте постукиванием.
Отжмите и инкубируйте реакционную смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Для хвостов Poly-A открутите образец и добавьте компоненты реакции Poly-A. Затем постучите, открутите вниз и инкубируйте реакционную смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов.
Для осаждения хлорида лития и количественного определения синтетической мРНК добавьте 50 микролитров 7,5 молярного хлорида лития и выполните осаждение хлорида лития. Достаньте аликвоту гелевого бульона ECM из морозильной камеры и храните его на льду. Разбавьте 10 миллиграммов на литр геля ECM до рабочей концентрации, смешав 990 микролитров DMEM с 10 микролитрами геля ECM в пробирке для микроцентрифуги.
Смешайте с помощью осторожного пипетирования. Добавьте по 60 микролитров разбавленного геля ECM в каждую из 16 лунок верхней камеры пластины CIM. Поместите верхнюю камеру пластины CIM со снятой крышкой пластины на защитный пластиковый лист внутри инкубатора с углекислым газом примерно на четыре часа, чтобы образовался слой геля.
Для электропорации добавьте по одному миллилитру DPBS в суспензию опухолевых клеток в каждую пробирку. Нажмите на клеточную суспензию и вращайте вниз три раза в течение 10 секунд. Удалите надосадочную жидкость с помощью микропипетки.
Добавьте 110 микролитров буфера суспензии R к клеточной грануле, чтобы получить 0,1 миллиона клеток в 10 микролитрах. Добавьте синтетическую мРНК в клеточную гранулу, чтобы получить концентрацию от 0,2 до 20 нанограммов на микролитр в зависимости от желаемого уровня экспрессии. Осторожно перемешайте и ресуспендируйте гранулы ячеек, постукивая по ним.
Далее электропорируют 10 микролитров клеточной суспензии с помощью системы электропорации при напряжении 1, 350 вольт в течение 10 миллисекунд с каждым тремя импульсами. После этого перенесите электропорированные клетки в новую микроцентрифужную пробирку с 1,1 миллилитрами DMEM, содержащей 0,5% FBS. Откройте программу анализа, дважды щелкнув значок программного обеспечения для анализа клеток в режиме реального времени.
Открыв параметр настройки шаблона эксперимента по умолчанию, выберите параметр для запуска трех экспериментов по отдельности. Откройте каждую колыбель, нажав на вкладку с номерами. Затем перейдите на вкладку Заметки об эксперименте.
Выберите папку и сохраните данные, введя название эксперимента. Щелкните вкладку компоновки и выберите четыре скважины одновременно, чтобы настроить четыре дубликата скважин для каждого условия обработки. Введите информацию о образце и нажмите «Применить».
Перейдите на вкладку «Расписание», затем добавьте шаг для настройки двухэтапного режима измерений импеданса ячейки. Затем нажмите кнопку Применить, чтобы настроить первый шаг. Снова нажмите «Добавить шаг» и введите 10 минут для интервала и 48 часов для длительности миграции и вторжения.
Затем нажмите «Применить», чтобы настроить второй шаг. За час до измерения импеданса клеток добавьте 160 микролитров DMEM, содержащего 10% сыворотку или другие химиоаттрактанты, в лунки нижней камеры пластины CIM. Соберите верхнюю камеру, содержащую лунки с гелевым покрытием ECM для инвазии или лунки без покрытия для миграции с нижней камерой.
Для анализа миграции клеток добавьте 50 микролитров низкой сывороточной среды в лунки верхней камеры пластины CIM. Поместите пластину CIM и подставку системы в CO2-инкубатор. Перейдите на вкладку сообщений.
Как только соединение будет выполнено, отобразится сообщение, табличка CIM готова к эксперименту. Предварительно инкубируйте собранную пластину CIM в инкубаторе углекислого газа в течение 30–60 минут перед анализом клеток в режиме реального времени, чтобы акклиматизировать планшет CIM к условиям культуры. Для получения базовых показаний нажмите кнопку «Пуск» для каждой базовой станции.
Когда появится окно Сохранить как, сохраните экспериментальный файл, чтобы выполнить базовое чтение. Для рассадки клеток извлеките пластину CIM из подставки и поместите ее в шкаф биобезопасности на держателе пластины. Затем добавьте 100 микролитров электропорированных клеток, содержащих 100 000 клеток, в лунки верхней камеры пластины CIM и оставьте пластину CIM под шкафом биобезопасности на 30 минут при комнатной температуре.
Измерьте импеданс ячейки, переместив полностью собранную пластину CIM обратно на соответствующую подставку. Начните измерение импеданса ячейки для второго шага, нажав кнопку запуска базовой станции и вкладку графика. Затем нажмите кнопку «Добавить все» и установите флажки «Среднее значение» и «Стандартное отклонение», чтобы визуализировать данные в режиме реального времени.
Электропорация клеток глиобластомы U 118 мг с различными концентрациями синтетического крэка одна мРНК приводила к концентрационно-зависимому увеличению белка с меченым крэком через сутки после трансфекции. 0,2 и два нанограмма на микролитр мРНК приводили к неопределяемой или умеренной экспрессии экзогенного белка крэк-один. 20 нанограммов на микролитр мРНК привели к более высокому уровню экспрессии, чем эндогенный крэк-один белок.
Анализ клеточной миграции показал, что электропорация составляла 0,2 или два нанограмма на микролитр трещины, одна мРНК не сильно влияла на миграцию клеток. Тем не менее, электропорация с 20 нанограммами на микролитр крэка одной мРНК привела к явной стимуляции клеточной миграции с большим количеством клеток, мигрирующих в период от 2 до 13 часов, показывая, что миграция клеток глиобластомы стимулировалась повышением уровня белка трещины один. Электропорация с синтетической мРНК крэка L приводила к устойчивой экспрессии меченого флагом белка L через сутки после трансфекции.
Инвазия контрольных клеток замедлялась с увеличением концентрации белка ECM. Трещина L над экспрессирующимися клетками показала зависимое от концентрации геля ECM снижение клеточной инвазии. Сравнение контрольной и экспрессирующей клеток с трещиной L при различных концентрациях геля ECM показало, что гиперэкспрессия трещины L в целом стимулировала клеточную инвазию через слой геля ECM.
Результаты также показали, что на две клеточные популяции по-разному влияло увеличение концентрации геля ECM в разные моменты времени. Клетки должны быть ресуспендированы быстро, осторожно и полностью в ресуспендированном пузырьке R, потому что длительная инкубация клеток в ресуспендированном пузырьке R делает клетки нездоровыми. Быстро и медленно мигрирующие опухолевые клетки могут быть выделены для характеристики различий между двумя клеточными популяциями.
