Этот метод используется для оценки подвижности сельскохозяйственных культур путем подсчета сокращения урожая и обнаружения распределения пищи только в пищеварительной. Преимущество этого метода в том, что он постоянно оценивает подвижность сельскохозяйственных культур. Это низкая стоимость и проста в работе.
Этот метод позволяет использовать только наполнитель в качестве модели для изучения пищеварительной функции на пищевых проходах в желудочно-кишечном тракте. Помочь продемонстрировать процесс будет Junmeng Xi, аспирант из моей лаборатории. Поддерживайте мух во флаконах, содержащих 10 миллилитров свежеприготовленной пищи в инкубаторе 25 градусов по Цельсию с влажностью 60% и 12-часовым светом, 12-часовым темным циклом.
Убедитесь, что большое количество фенотипа желания мух выкрывать одновременно путем культивирования молодых мух со стандартной пищей с сухими дрожжами затем передать взрослых мух на флакон с мокрыми дрожжами и позволяют два дня для откладывания яиц. Оставьте яйца в инкубаторе для разработки и передачи взрослых мух на новый флакон, чтобы собрать больше яиц. Соберите исключенных мужских или женских мух каждый день и культуры их в новых флаконах со стандартной пищей до желаемого возраста.
Обезболивать мух углекислым газом и передавать одну муху в вскрытии пластины хорошо с 200 микролитров PBS. Возьмите муху на грудной клетке с парой пинцета и открыть грудную клетку с другой парой пинцета затем тянуть концы в противоположных направлениях, чтобы открыть живот. Аккуратно вынюхайте урожай и кишечник из тела и ждите, пока муха проснется.
Когда муха проснется, подсчитайте количество раз, когда урожай контрактов в одну минуту. Повторите подсчет сокращения пять раз, ожидая 30 секунд между каждым счетом. Взвесите синий краситель и растворите его в PBS при концентрации 20%.
Затем перемешайте его в кипяченую жидкость поддержания пищи до окончательной концентрации 5% во время процесса охлаждения пищи. После хранения мух во флаконах с голодной пищей в течение четырех часов, перенесите их в новые флаконы с окрашенной пищей и культуры их в течение желаемого времени, имея в виду, что в условиях технического обслуживания пища проходит через муху примерно через два часа. Перенесите анестезированую муху в вскрытую пластину, хорошо содержащую 200 микролитров PBS.
Используйте пинцет, чтобы схватить муху на грудной клетке и удалить голову с другой парой пинцета, а затем передать тело в новый колодец с PBS и мыть его с нежной тряски, чтобы удалить краситель прилагается к телу. Откройте брюшную полость двумя парами пинцета и тщательно отделите весь кишечник от тела. Свяжай урожай со всего кишечника и положи в трубку со 100 микролитров PBS.
Положите остальную часть кишечника в другую трубку с 100 микролитров PBS затем использовать пипетки советы молоть урожай и кишечник и растворить краситель в PBS. Повторите вскрытие до тех пор, пока не будет собрано достаточное количество культур и кишки. После сбора образцов центрифуга труб на максимальной скорости в течение одной минуты и передача 90 микролитров супернатанта в колодец 96 хорошо пластины.
Сделать серию стандартных разбавлений синего красителя в концентрациях от одного раза 10 до 7 до 10 до 4 граммов на миллилитр и добавить их в скважины. Измерьте абсорбанс на 630 нанометров скважин и используйте стандартные измерения, чтобы построить линейный график поглощения против концентрации красителя. Затем используйте кривую для расчета концентрации красителя образцов.
Анализ подвижности сельскохозяйственных культур использовался для подсчета сокращений сельскохозяйственных культур на трехдневных мухах-мутантах NPRL и генетическом фоне. Было установлено, что мутация значительно снижает скорость сокращения урожая. Для дальнейшего подтверждения функции NPRL2 на урожай, движение пищи было обнаружено путем кормления окрашенных продуктов питания мух.
Все мухи имели аналогичное количество красителя в урожае, но NPRL2 мухи меньше красителя в кишечнике, которые могут быть связаны со снижением скорости сокращения урожая. При вводе этого протокола, убедитесь, что урожай остается контакт с телом и муха жива и бодрствует. В противном случае урожай потеряет способность к контракту.
Во время процесса вскрытия, урожай и кишечник должны быть в контакте. Если краситель просачивается в среду вскрытия, образец больше не может быть использован. Давайте просто заполнить наш аппетит и выброс пищи в течение короткого времени также могут быть оценены путем обнаружения количества красителя во всем кишечнике.
