Несмотря на то, что были проведены исследования потери слуха, вызванной шумом, ни в одном из них этот метод не был описан так подробно, что делает эту процедуру важной. Этот метод эффективно вызывал у мышей потерю слуха, вызванную шумом, и наблюдал за фактическими изменениями порога слышимости по ABR. Модель потери слуха, вызванной шумом, на животных полезна ученым для глубокого понимания механизма потери слуха, вызванной шумом, и последующей оптимизации соответствующих стратегий лечения.
Демонстрацию процедуры будет демонстрировать Диан-Шиуэ Ли, очень талантливая студентка из моей лаборатории. Чтобы подготовить клетку для подопытных мышей, используйте клетку-ловушку для крыс и нарежьте четыре куска гофрированных пластиковых досок соответствующих размеров, чтобы они поместились в клетку. Чтобы мыши не порезали лапы сетчатой сеткой, поместите две части на нижнюю и заднюю сторону соответственно.
Расположите две другие части перпендикулярно друг другу, чтобы разделить пространство внутри клетки на четверти Откройте прикладное программное обеспечение CLIO. Наведите курсор на значок динамика и нажмите на TwoSin. Введите и измените значение Частота 1 на 1 000 Гц, Частота 2 на 6 000 Гц и нажмите кнопку ОК, чтобы начать воспроизведение звука.
На вкладке Leq измените dBV на dBSPL. Установив время в интерфейсе программы, нажмите кнопку с зеленым треугольником, чтобы воспроизвести звук. Поместите микрофон перед динамиком на расстоянии 8,5 сантиметров, чтобы откалибровать уровень шума.
Отрегулируйте уровень шума до 125 децибел SPL-A и непрерывно контролируйте его в течение не менее трех минут, чтобы убедиться, что уровень шума достаточно стабилизирован. Используйте генератор, анализатор и усилитель для создания и управления шумом. Поместите в клетку четырех самцов черных мышей C57 6J, по одной на каждую четверть, для воздействия шума.
Случайным образом распределите мышей по каждой четверти во время воздействия шума. Разместите микрофон в верхней части клетки, чтобы контролировать уровень шума во время воздействия шума. Поместите каркас перед динамиком в звуконепроницаемую коробку, убедившись, что динамик расположен на расстоянии 8,5 см от каркаса.
Подвергайте мышей воздействию шума на частотах один килогерц и шесть килогерц непрерывно в течение шести часов в день в течение пяти дней подряд. Измерьте пороги слышимости мышей на 6-й и 13-й день, измерив ABR. Используйте коммерческую систему тестирования ABR, специально разработанную для мелких животных для измерения ABR, и держите животное под общим наркозом.
Поместите 12-миллиметровые подкожные игольчатые электроды в макушку за ушной раковиной левого уха и обратно возле хвоста, чтобы измерить порог слышимости. Расположив динамик на расстоянии одного сантиметра от левого уха животного, подайте акустические стимулы с помощью динамика. Выберите синусоиду для стимулов и 10 k для оконной шкалы.
Поверните ручку частоты, чтобы получить желаемую частоту акустических раздражителей. Отрегулируйте интенсивность стимула, повернув ручку AMLP на генераторе функций. Получите желаемую интенсивность стимула, повернув ручку AMLP на подходящее напряжение, рассчитанное по калибровке.
Соберите измерения ABR при серии интенсивностей стимулов от 10 до 100 децибел SPL с шагом 10 децибел. Отметьте минимальный уровень интенсивности стимула, который может привести к возникновению различимой волны V, в качестве порога ABR. Принесите в жертву мышей после измерений ABR и соберите улитки у усыпленных мышей.
Сразу после сбора тканей погрузите их в 10%-ный формальдегид для фиксации и дайте им отдохнуть не менее восьми часов при температуре четыре градуса по Цельсию. Используйте ЭДТА для декальцинации, как описано в тексте. Поместите улитки в чашку Петри, наполненную PBS.
Для окрашивания тканей разрежьте спиралевидный орган корти, или ОК, на три части: базальный поворот, средний виток и апикальный поворот. Под препарирующим микроскопом при увеличении от 8 до 35 раз удаляют костные структуры, включающие scala vestibuli, scala tympani и modiolus декальцинированных улиток, и получают мягкие ткани, включая OC. Значительное повышение порога слышимости наблюдалось на частотах 12 килогерц, 24 килогерц и 32 килогерц через сутки после воздействия шума. Частичное восстановление слуха произошло через неделю после воздействия шума, но пороги слышимости все еще были повышены более чем на 30 децибел на всех частотах по сравнению с контрольными группами.
В этом исследовании слух был более поврежден на высоких частотах. Достоверная разница в пороге слышимости наблюдалась между контрольной и экспериментальной группами как на 6-е, так и на 13-е сутки, на частоте 12 килогерц и 32 килогерц. Потеря наружных волосковых клеток постоянно наблюдалась на микроскопических изображениях, полученных от мышей NIHL, по сравнению с теми, которые были получены от контрольных мышей.
В то время как внутренние волосковые клетки оставались нетронутыми на всех изображениях, внешние волосковые клетки в базальном и среднем витках ОК были серьезно повреждены. Напротив, наружные волосковые клетки в апикальном повороте были почти не повреждены. Наиболее важный этап в этом протоколе включает в себя воздействие шума, измерение ЛПИ, сбор улитки.
Эта процедура может быть применена для исследования влияния шумового воздействия на различных частотах на потерю слуха с использованием различных типов звука.
