Этот метод выявляет жизнеспособные глазные конъюнктивальные микроорганизмы, что является сложной задачей из-за враждебной среды глаз. Это может помочь ответить, существует ли глазной микробиом и как бактериальное присутствие изменяется при заболеваниях глаз. В отличие от секвенирования ДНК, которое идентифицирует как жизнеспособные, так и нежизносимые микроорганизмы, этот метод идентифицирует только жизнеспособные микроорганизмы, что приводит к более четкому пониманию глазного комменсального сообщества.
Исследования показывают, что трудно диагностируемые заболевания глаз, такие как неаоиммунная и аутоиммунная сухость глаз, имеют уникальное глазное бактериальное присутствие. Этот метод может быть использован для диагностики глазных заболеваний с отличительными микробными сигнатурами. Начните с автоклавирования соответствующего количества хлопчатобумажных ватин и зубочисток для количества мышей, которые должны быть смазаны, затем отщипните кусок хлопчатобумажной ваты длиной 1/2 сантиметра и вытащите его, потянув за края, чтобы сформировать плоский пористый слой, останавливающийся непосредственно перед тем, как ватин развалится.
Закрутите ватин вокруг одного из острых концов зубочистки, слегка удерживая вытянутый кусок на кончике зубочистки, когда он скручивается. Готовый глазной тампон будет иметь очень тонкий слой хлопка, натянутый на кончик, простирающийся примерно на 1/2-2 сантиметра от кончика. Вставьте тампоны в небольшой комок, смачивайте их стороной вниз, затем накройте и автоклавьте их.
Очистите рабочую зону дезинфицирующим средством, чтобы свести к минимуму загрязнение, и аликвотными 0,5 миллилитрами стерильной мозговой инфузии сердца или средой BHI в меченые 1,5-миллилитровые стерильные микроцентрифужные трубки. Замыкайте трубки в стойку и установите стойку на лед. Настройте рабочий процесс слева направо, начиная с мышиной анестезирующей станции, которая содержит клетку с экспериментальными мышами, пустую стерильную клетку, анестезию комнатной температуры, иглу 25 калибра и один миллилитр шприца.
Затем подготовьте станцию для мазка глаз, которая содержит аликвотированный BHI на льду, стерилизованные глазные тампоны, смазывающие глазные капли, контейнер для биологической опасности, чистые бумажные полотенца и 70% изопропаноловый спрей. Наконец, установите станцию покрытия с агарными пластинами крови комнатной температуры, пипеткой 10 микролитров, 10 микролитровыми стерильными одноразовыми наконечниками и контейнером для отходов биологической освидетельствования. Убедитесь, что мышь правильно обезболена, сжав заднюю подушечку для ног.
Продолжайте только в том случае, если нет движения. Назначьте одну руку для обработки анестезированных мышей, а другую руку для обработки глазного тампона и культуры. Извлеките мышь из клетки и поместите ее поверх рабочей поверхности, расположенной на боку с открытым левым глазом.
Распылите на руки перчатки изопропанол и высушите их бумажным полотенцем. Сдвиньте маркировку микроцентрифуги BHI с помощью специальной руки для обработки среды и поместите их обратно в стойку. Опустите покрытый ватой кончик глазного тампона в BHI, затем извлеките тампон из трубки, дважды вращая наконечник о внутреннюю трубку, чтобы удалить лишнюю жидкость и удалить ее.
Рукой мыши осторожно держите мышь за шею. Другой рукой поместите кончик глазного тампона против медиал-конъюнктивальной области левого глаза. Слегка прижмите глазное яблоко и переместите тампон в оконном моющее движение между нижним веком и глазом 10 раз, поддерживая постоянное давление.
Не касаясь меха, аккуратно удалите кончик тампона перпендикулярно тому, куда он был вставлен. Поместите тампон ватной стороной вниз, непосредственно в помеченную микроцентрифужную трубку со средой BHI. Нанесите глазную каплю на промванный глаз.
При желании приобретите мазки из кожи или меха для контрольных образцов, соответствующим образом стерилизовав перчатки между каждым тампоном. По завершении верните мышь в клетку. Дайте тампону постоять 10-15 минут на льду, затем стерилизуйте руки в перчатках и удалите тампон, смешивая наконечник в среде в течение 10 оборотов.
Вытащите тампон, поворачивая наконечник к внутренней стенке трубки в течение пяти оборотов и утилизируйте его в контейнер для биологической огорожности. Повторите этот процесс для каждой мыши. Обогатите образец, высиживая трубку статически в течение одного часа при 37 градусах Цельсия.
Во время инкубации наметьте одну пластину TSA комнатной температуры на глаз мыши или контрольный тампон и разделите ее пополам. Извлеките обогащенные образцы из инкубатора и поместите их на лед. Кратковременно вихрьте образцы для смешивания, затем аликвотируйте 10 микролитров образца на пластину TSA и наклоните пластину, чтобы сформировать полосу.
Повторите это дважды. По другую сторону от пластин разделительной линии создайте 10 точек по 10 микролитров образца каждая. Инкубировать пластины при 37 градусах Цельсия в течение 18 часов, двух дней и четырех дней в чистой камере, которая предотвращает высыхание агаровых пластин.
Подсчитайте колонии в полосы. Обратите внимание на морфологию и рассчитайте колониеобразующие единицы на мазок для морфологически сходных изолятов. Посмотрите на точки, где уникальные организмы не захвачены в полосках.
Чтобы облегчить визуализацию, мы плотно покрыли бактерии в средней и правой пластинах. Как правило, мы наблюдали гораздо меньше бактерий в глазных тампонах. Обратите внимание, что иногда глазные тампоны могут не давать восстанавливаемых бактерий.
Здесь показана репрезентативная глазная тампоновка с морфологически разнообразными изолятами от черной шестимышки C57. Для каждого отдельного изолята колонии были подсчитаны в полосе, а относительная численность была рассчитана и нанесена на график. Для микробиологической характеристики бактерии были отобраны из отдельных пластин для мазков глаз мыши для получения главной пластины TSA.
Когда появился рост, были проведены дополнительные тесты для характеристики или идентификации микробов. Мастер-пластина использовалась для обеспечения достаточного количества инокулята для расширения соответствующих изолятов. Для выявления изолятов пластину TSA прошивали и инкубировали в течение ночи, а также проводили MALDI-TOF MS.
Примеры изолятов, показанных здесь, были идентифицированы как Streptococcus acidominimus и Aerococcus viridans. Значительно различные уровни комменсальных организмов были извлечены у самцов и самок C57 черных шести мышей. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans коагулируют отрицательные стафилококки и E.coli были выделены из C57 черных шести N мышей.
При попытке этого протокола имейте в виду, что наилучший результат будет достигнут путем тонкого покрытия тампона и времени во время этапа тампонирования глаз. Если доступ к MALDI-TOF MS ограничен, то изоляты могут быть идентифицированы путем микробиологического и биохимического тестирования.
