Выделение высокочистых пластоглобул имеет решающее значение для их изучения. Здесь представлен быстрый и эффективный протокол их выделения, который облегчает их биохимическое исследование. Основным преимуществом этого метода является относительная скорость процедуры и ее приспособляемость к многочисленным видам растений и условиям окружающей среды.
Особую осторожность необходимо соблюдать при обработке ультразвуком тилакоидных ресуспензий для обеспечения достаточной силы для удаления пластоглобул из тилакоидов и с последующим извлечением пластоглобул из градиента сахарозы. Продемонстрировать эту процедуру будут доктор Эльсинраджу Девадасу, научный сотрудник моей лаборатории, и Фебри Сусанто, аспирант в моей лаборатории. Начните с приобретения трехнедельных саженцев шести здоровых сортов кукурузы, имеющих стадию роста V5 и весом около 120 граммов.
Отрежьте все листья у основания стебля и быстро окуните их в ледяную ванну, прежде чем транспортировать их в холодную комнату. Работая под зеленой лампой безопасности, извлеките листья кукурузы из ледяной ванны и разрежьте их на более мелкие кусочки размером пять на пять сантиметров с помощью ножниц. Аккуратно и тщательно измельчите половину обрезанной ткани листа в 350 миллилитрах измельчающего буфера на уровне ниже семи на коммерческом блендере.
Запускайте и останавливайте блендер пять-шесть раз, чтобы убедиться, что все листья срезаны. Отфильтруйте гомогенат через один слой 25-микронной нейлоновой ткани на большой воронке до четырех 250-миллилитровых бутылок центрифуги. После повторения этапа смешивания с оставшейся обрезанной тканью листа равномерно разделите фильтрат между четырьмя флаконами.
Удалите аликвоту листового фильтрата и отложите ее в сторону для хранения в качестве репрезентативного общего образца листа. Затем центрифугируйте фильтрат в течение шести минут при 1, 840 G и четырех градусах Цельсия. Вылейте полученный супернатант и легкими закрученными движениями щетки повторно суспендируйте гранулу в 12 миллилитрах среды R0,2, содержащей 0,2 молярной сахарозы.
После повторного использования гранулы в одном флаконе добавьте суспензию в следующую бутылку и повторите повторное суспензию, чтобы объединить суспензии в один флакон. Распределите объединенную суспензию между шестью трехмиллилитровыми ультрацентрифугными трубками, достигнув максимального объема 2,5 миллилитра в каждой трубке. Затем используйте наконечник ультразвукового аппарата с амплитудой 100%, чтобы обработать каждую трубку ультразвуком четыре раза в течение 10 секунд каждая.
Убедитесь, что звуковой сигнал ультразвукового аппарата находится под водой и подальше от поверхности жидкости, чтобы предотвратить вспенивание. Медленно перемещайте звуковой сигнал sonicator вверх и вниз внутри подвески во время каждого раунда. Чередуя четыре трубки, возвращайте каждую трубку в ведро со льдом после каждой обработки ультразвуком, чтобы дать образцу остыть.
После этого центрифугируйте обработанную ультразвуком сырую суспензию тилакоида при 150 000 г в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Скользите по поверхности подушки, используя шприц и иглу 22-го калибра, и соберите полученную желтую и маслянистую плавающую прокладку из сырых пластоглобул из подушки сахарозы. Извлеките приблизительно 500 микролитров из каждой трубки и поместите их в 2,0-миллилитровую трубку.
Собирайте сырые тилакоидные аликвоты до и после обработки ультразвуком и высвобождения пластоглобул. После этого либо продолжайте обработку растительной ткани, либо храните сырые пластоглобулы при минус 80 градусах Цельсия и очищайте их позже. Вырастите 50 миллилитров культуры synechocystis вида PCC 6802 в среде BG11 в течение 7-10 дней, чтобы достичь стационарной фазы.
Используя спектрофотометр, отрегулируйте плотность ячейки до оптической плотности 2,0 при 750 нанометрах. Чтобы удалить полисахариды, центрифугируют 50 миллилитров культуры и удаляют надосадочный агент. Повторите промывку клеток в 50 миллилитрах буфера А два раза.
Повторно суспендируйте промытую гранулу в 25 миллилитрах буфера А и разбейте ячейки с помощью французской напорной ячейки на 1 100 фунтов квадратных дюймов. Повторяйте процесс три раза в холодных условиях до тех пор, пока цвет лизирования не изменится с зеленого на красный, синий, зеленый при белом свете. Удалите аликвоту гомогената клетки и отложите ее для хранения в качестве репрезентативного общего образца клетки.
Распределите полученный гомогенат в восьми трехмиллилитровых ультрацентрифужных трубках, заполненных максимум до 2,5 миллилитров в каждой трубке. Наложите этот гомогенат на 400 микролитров среды R, получив градиент шага. Тщательно балансируйте трубки, добавляя дополнительную среду R по мере необходимости перед центрифугированием трубок.
Тилакоид и другие более тяжелые органеллы, включая любые полигидроксиалканоатные тела, показывают образование гранул, в то время как пластоглобулы образуют желтую маслянистую прокладку на или около верхней части градиента сахарозы. Соберите полученную плавающую подушку из сырых пластоглобул с помощью шприца, как показано ранее, и поместите урожай в двухмиллилитровую трубку. При необходимости соскоблите пластоглобулы со стороны стенки ультрацентрифужной трубки кончиком иглы.
Либо продолжайте обработку цианобактерий, либо храните сырые пластоглобулы при минус 80 градусах Цельсия и очищайте позже. Чтобы собрать чистые пластоглобулы с использованием метода обработки растительной ткани, подготовьте градиент сахарозы, описанный ранее, используя 500 микролитров сырых пластоглобул, 400 микролитров среды R 0,2 и 400 микролитров среды R. После центрифугирования соберите полученную плавающую прокладку чистых пластоглобул в двухмиллилитровую трубку. После аликотирования чистых пластоглобул и мгновенного замораживания аликвот в жидком азоте либо хранят их при минус 80 градусах Цельсия, либо лиофилизируют в сухой порошок.
Чтобы собрать чистые пластоглобулы из цианобактерий, создайте градиент сахарозы, как упоминалось ранее, используя 500 микролитров сырых пластоглобул, 750 микролитров среды R 0,7 и 750 микролитров среды R 0,2. После центрифугирования соберите чистые пластоглобулы в 1,5-миллилитровую трубку и аликвотируйте чистые пластоглобулы. После этого заморозьте чистые пластоглобулы аликвоты в жидком азоте и храните их непосредственно при минус 80 градусах Цельсия или лиофилизируйте в сухой порошок.
В этом методе было замечено значительное количество пластоглобулы или липидного капельного материала, плавающего на верхнем слое подушки сахарозы. После последующего центрифугирования очищенные пластоглобулы получали на поверхности градиента сахарозы или вблизи нее. После успешного выделения пластоглобул иммуноблоты, разработанные для оценки чистоты с использованием антител, выращенных против арабидопсиса талиана фибриллина 1а и фотосистемы arabidopsis thaliana II субъединицы D1, показали, что гомологи фибриллина были в первую очередь связаны с тилакоидами, чем пластоглобулы.
Чтобы обеспечить эффективное и концентрированное извлечение плавающей площадки, поместите отверстие иглы шприца чуть ниже жидкой поверхности буфера, будучи полностью погруженным, а затем осторожно подтяните вверх. Изолированные образцы пластоглобул поддаются последующим протеомным или липидомическим исследованиям и были использованы для демонстрации изменений в целевом белково-липидном составе в различных условиях окружающей среды. Этот метод облегчил новые исследования пластоглобулы, включая открытие связанной активности протеинкиназы и присутствия олигомерных белковых комплексов посредством последующего биохимического исследования.
