Этот протокол содержит инструкции по строительству и использованию системы Bubble Column Photobioreactor для выращивания микроводоразводов, и должен быть интерес для тех, кто изучает алгель биотоплива, очистки сточных вод, или алгель биологии. Мы нашли систему реактора шпиля для того чтобы произвести высоки авторитетные результаты. Реакторная система также настраивается на широкий зазвон водорослей и стоит гораздо меньше, чем многие коммерческие предложения.
Демонстрацией процедуры будет Цичен Ван, аспирант моей лаборатории. Чтобы начать установку Bubble Column Photobioreactors, построить набор вентилируемых крышки из пластиковых крышек одного литра стеклянных бутылок и гибридизации труб, как описано в текстовом протоколе. Slip 1 / 4 дюйма O кольцо над протекторами 1/8-дюймовый панель крепления приманки установки, и слайд это в 1 / 4 дюйма отверстие пробурено в крышке.
Проскользните второй 1/4 дюйма над нитями так, чтобы крышка была зажата между двумя кольцами O. Затем поскользнуться замок гайку на нити и затянуть его, чтобы исправить панель горе приманки на месте. Теперь оснастки, чтобы заблокировать кольца на подвергаются мужской приманки, проецирование из крышки.
Повторите эту процедуру для каждого отверстия в крышке. Для крышки, которые будут использоваться на bubble колонки и бутылки реакторов, приложите 1/8-дюймовый женский приманку для колючей фитинги на 1 1 / 2 дюйма куски 1/8-дюймовый ID ПВХ трубки. Прикрепите их к каждому из открытых мужских фитингов приманки на крышке.
Подключите контрольный клапан к свободному концу одной из 1/8-дюймовых частей. Затем подключите мужскую приманку к установке колючки для второй части 1/8-го дюйма трубки проецирования от крышки. Нажмите вращающийся замок кольцо на место и закрепить 0,2 микрон воздушный фильтр для этого.
Compleat сборки системы доставки воздуха, аквариумы, перемешать пластины, и огни, как descried его текст протокола. Сосредоточьте оседлый запас микроводо микроводочан, удалив супернатент с помощью вакуумного насоса. Оставьте менее 100 миллилитров медиума в каждой бутылке, но избегайте удаления оседлых водорослей.
Приостановить и передать водоросли суспензии стерильных 50 миллилитров центрифуги труб. Центрифуга 1000 раз G в течение пяти минут, чтобы еще больше сконцентрировать водоросли. В кабинете биобезопасности удалите достаточное количество супернатантов, чтобы достичь общего объема около 80 миллилитров концентратов водорослей для 12 фотобиореакторов.
Избегайте пылесосить гранулы. Перенесите концентрат водорослей в стерильный контейнер. Теперь добавьте шесть миллилитров навоза водорослей в каждый фотобиореактор со стерильным 10 миллилитровым серологическим пипеткой.
Закружить биореакторы, чтобы смешать водоросли в среде. Нарисуйте двухми миллилитровый образец из каждого биореактора с помощью серологического пипетки и перенесите в двухми миллилитровую трубку. Соберите двухми миллилитровую выборку каждые 24 часа для мониторинга культурного прогресса.
Проверьте образец на ph с помощью тест-полосок и отрегулируйте реактор по мере необходимости. Затяните крышки биореактора и поместите все биореакторы в ванну для воды аквариума. Отрегулируйте аэрацию, углекислый газ и освещение до соответствующих уровней для вида.
Поверните положение биореактора каждый день после отбора проб. Примените 200 микролитров каждого образца культуры в трипликате к колодцам микроплюта 96 скважин. Затем измерьте оптическую плотность на 550 нанометров и 680 нанометров.
Измерьте фиксированный объем культуры водорослей от каждого биореактора с цилиндром выпускника и перенесите в бутылки центрифуги. Центрифуга культуры 4, 696 раз G в течение пяти минут. Отбросьте супернатент, тщательно пылесосить его.
Перенесите гранулы на помеченные 50 миллилитровые трубки. Промыть центрифуги бутылки с дистиллированной водой и передать содержимое 50 миллилитров труб. Убедитесь, что общий объем не превышает 45 миллилитров.
После мытья гранул водорослей, как описано в текстовом протоколе, отбросить супернатант. Затем добавьте 7,5 миллилитров дистиллированной воды в каждую 50 миллилитровую трубку. Теперь, вихрь 50 миллилитров труб и передачи водорослей шламы в предварительно взвешенных 15 миллилитров труб.
Промыть 50 миллилитров трубки с дополнительной дистиллированной водой, и передать жидкость в 15 миллилитров труб поддержанию общего объема в этих трубах до менее чем 12 миллилитров. После центрифугирования 15 миллилитров труб и отбрасывания супернатента, как и прежде, заморозить трубки с гранулами при температуре минус 80 градусов по Цельсию, по крайней мере 30 минут в рамках подготовки к заморозке сушки. Добавьте 1,5 миллилитров растворителя фолиевой кислоты в каждую две миллилитровые трубки, содержащие 20 миллиграммов лиофилизированных водорослей.
Налейте около 0,5 миллилитров zirconia кремнезема бусы в каждую трубку, пока уровень жидкости достигает двух миллилитров. Гомогенизировать образцы водорослей в бисерной мельнице в течение 20 секунд со скоростью 6,5 метров в секунду. Перенесите трубки на лед в течение 30 секунд, чтобы охладить образцы.
Затем повторите еще пять раз, чтобы полностью извлечь липиды. Фильтр гомогената через пять миллилитров шприц, содержащий диск сетки из нержавеющей стали, чтобы процедить бисер, собирая фильтрат в 15 миллилитровую трубку. Вымойте бисер с 1,5 миллилитров растворителя фольха, толкая жидкость через с сирингом по мере необходимости.
Повторите эту стирку еще 2 раза и соберите весь фильтрат в 15 миллилитровой трубке, что даст окончательный объем около шести миллилитров. Добавьте 1,2 миллилитров раствора хлорида натрия в экстракт фолиевой кислоты в 15 миллилитровой трубке и вихрь, чтобы хорошо перемешать. Центрифуга 15 миллилитров труб при 6000 раз G в течение пяти минут.
Завещайте объем нижней фазы хлороформа до ближайшего 0,1 миллилитра, используя линии на стороне 15 миллилитровой трубки. Затем перенесите нижнюю фазу на стеклянную мерзкую, используя стеклянную пастбищную пипетку. Для выполнения нейтрального липидного анализа, разбавить липидные экстракты и растительное масло стандарт в три раза с метанолом.
Для каждого разбавленного образца добавьте 80 микролитров к 96 хорошо полипропиленовой микроплее в четыре раза. Для растворителя пустой, нанесите 80 микролитров растворителя фольха в четыре раза. Для стандартов добавьте 10, 30, 60, 90 и 120 микролитров разбавленного растительного масла стандарта также в четыре раза.
Поместите микроплатформу в капот дыма на разогретый сухой блок нагреватель при 55 градусах по Цельсию в течение 20 до 30 минут, пока весь растворитель не испарится. Снимите микроплюй с нагревательного блока и дайте ему остыть до комнатной температуры. Затем добавьте 30 микролитров изопропилового спирта к каждой хорошо и перемешайте, трубя вверх и вниз.
Убедитесь, что все пипетки каналы смешивания раствора и повторного высасывания липидов, что дает однородной зеленой жидкости. Теперь добавьте 200 микролитров по одному микрограмму на миллилитр красного раствора Нила к каждой хорошо, и труба его вверх и вниз 10 раз, чтобы смешать. После пятиминутной инкубации при комнатной температуре добавьте 20 микролитров раствора 50%bleach к каждой колодец, и трубы его вверх и вниз пять раз, чтобы хорошо перемешать.
Оставьте плат инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре. Через 30 минут, читать флуоресценции в образцах каждые пять-десять минут на 530 нанометров возбуждения, 575 нанометров выбросов, с автоматической отсеивания установлен на 570 нанометров, пока сигнал от образцов водорослей стабилизируется. Эта процедура дает ход времени данных оптической плотности алгеля на OD 550 нанометров.
Культуры контроля выращивались на свежем анатом NH4. Лечение один, является со-культуры auxenochlorella прототекоидов и azospirillum brasiliense, выращенных на свежей врожденной среде NH4. Лечение два, является azinic A.Protothecoides, выращенных на врожденной среде NH4 дополнен 50 миллиграммов на миллилитр IAA, который полностью ингибирует рост водорослей.
Лечение три, является azinic A.Protothecoides, выращенные на провел среды от A.Brasilienes. Кривые роста показывают культуры auxenochlorella прототекоидов ввести поздний логаритмический рост в 120 часов. Здесь показаны кривые ядра между оптической плотностью 550 нанометров и конечной концентрацией сухого веса, используя полиномиальный припадок второго порядка.
Наконец, окраска может быть применена к данным оптической плотности времени для получения кривой сухого роста веса. Такие же процедуры используются здесь, за исключением того, что хлорелла sorokiniana является культурным вместо auxenochlorella прототекоидов. Процент сухого веса нейтрального липида, полученного в нейтральном липидном анализе, хорошо коррелирует с содержанием триозного глицерола на соответствующей тонкослойной хроматографической пластине.
В отличие от A.Protothecoides, лечение IAA не препятствовало росту C.Sorkiniana. После извлечения липидов водорослей, оставшийся клеточный поддон может быть проанализирован на содержание крахмала и клеточной стенки, обеспечивая более подробную картину продуктов хранения энергии в клетке. Описанные здесь методы позволили сделать новые открытия в области биотоплива алгеля и очистки сточных вод.
В частности, эта система была использована, чтобы лучше понять, как бактерии влияют на рост алгеля.
