Функциональные исследования генов риккетсии имеют решающее значение для понимания их роли в патогенезе, поэтому нам нужны надежные методы контролируемого изменения генов. Наш протокол использует электропорацию для введения экзогенной ДНК в облигатные внутриклеточные бактерии рода Rickettsia, что позволяет нам изучать эффекты введенной ДНК. Продемонстрировать процедуру вместе со мной сегодня будет Лиза Прайс, исследователь из лаборатории доктора Мундерло и доктора Куртти.
Для начала подготовьте от 90 до 100% инфицированной Rickettsia parkeri клеточной культуры ISE6, как описано в тексте. Затем, чтобы определить скорость заражения окрашиванием Гиемса, разбавляют клеточную суспензию до соотношения 1:5 с полной средой и наносят 100 микролитров клеточной суспензии на предметное стекло микроскопа центрифугированием при 113 Г в течение пяти минут. Дав слайду высохнуть на воздухе, зафиксируйте его абсолютным метанолом в течение пяти минут при комнатной температуре.
Затем высиживают горку и окрашивают Giemsa в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия. Затем промойте горку в воде и после высыхания просмотрите ее под световым микроскопом с масляными объективами. Определите процент инфицированных клеток, подсчитав инфицированные и неинфицированные клетки.
Чтобы приготовить бесклеточный Rickettsia parkeri, налейте около 0,2 миллилитра стерильной зернистости от 60 до 90 карбида кремния в две двухмиллилитровую стерильную микроцентрифужную трубку и отложите трубки в сторону. Из ранее привитой rickettsia parkeri-инфицированной колбы, содержащей пять миллилитров среды, удаляют два миллилитра среды, следя за тем, чтобы не нарушить клеточный слой. Затем повторно суспендируют клетки оставшимися тремя миллилитрами среды.
Разделите эту суспензию поровну между двумя подготовленными трубками из карбида силикона и вращайте трубку на высокой скорости в течение 30 секунд. Затем поместите их на лед. Затем подготовьте стерильный пятимиллилитровой шприц luer lock, удлинив плунжер, и вставьте конец плунжера в полистирольную основу, используемую для удержания 15-миллилитровых конических трубок.
Используя барьерную двухмиллилитровую пипетку Пастера, управляемую резиновой колбой, аккуратно удаляют надосадочную вихревые ячейки без аспирации какой-либо песчинки. Затем вставьте наконечник пипетки в отверстие ступицы шприца и вытолкните содержимое в шприц с мягким давлением. Затем отфильтруйте культуру Rickettsia parkeri в стерильные 1,5-миллилитровые трубки через стерильный двухмикрометровый фильтр размера пор, установленный на шприцевой ступице, и центрифугируйте трубки при 13 600 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
После удаления надосадочного вещества промыть ячейку гранулу два раза 1,2 миллилитрами 300-миллимолярного ледяного раствора сахарозы. Центрифугируйте образец и удалите супернатант между промывками. В конце центрифугирования повторно суспендируют объединенную ячейку гранулы со 100-150 микролитрами ледяного раствора сахарозы для двух-трех образцов трансформации соответственно.
Затем разделите образец на 50-микролитровые аликвоты в предварительно охлажденных, стерильных, 1,5-микролитровых микроцентрифужных пробирках. Для трансформации на три микрограмма безэндотоксина pRAM18sSFA плазмидной ДНК в каждую трубку, содержащую 50 микролитров Rickettsia parkeri на льду и осторожно перемешайте кончиком пипетки. Переложите смесь в предварительно охлажденную стерильную электропорационную кювету с размером зазора 0,1 сантиметра.
Осторожно постучите по кювете, равномерно распределите смесь и высиживайте на льду в течение 10-30 минут. Между тем, удалите среду из полностью сливающейся ранее культивируемой колбы культуры клеток ISE6 и повторно суспендируйте клеточный слой, осторожно промыв клетки 1,5 миллилитрами свежей среды, содержащей бикарбонат натрия и буфер HEPES. После получения однородной клеточной суспензии переведите весь объем в одну стерильную двухмиллилитровую микроцентрифужную трубку.
Далее электропорируют смесь Rickettsia parkeri и плазмидной ДНК с помощью электропоратора. После электропорации используйте стерильную расширенную пипетку с тонким наконечником, чтобы перенести небольшое количество клеточной суспензии ISE6 в кювету и осторожно пипетку вверх и вниз, чтобы восстановить электропорированную Rickettsia parkeri. Затем перенесите содержимое кюветы в двухмиллилитровую трубку, содержащую оставшуюся часть клеточной суспензии ISE6.
Затем центрифугируют образец при комнатной температуре, сначала при 700 G в течение двух минут, чтобы потянуть вниз клетки ISE6, а затем при 13 600 G в течение одной минуты, чтобы потянуть вниз риккетсию. Инкубируйте трубку при температуре 34 градуса Цельсия в течение 15 минут до одного часа. После инкубации переносят повторно суспендированное содержимое одной трансформации в одну колбу для культивирования клеток площадью 25 квадратных сантиметров, содержащую 3,5 миллилитра свежей среды с бикарбонатом натрия и буфером HEPES.
Раскачайте колбу, чтобы равномерно распределить смесь и инкубировать при 34 градусах Цельсия. Через 16-24 часа добавьте по 10 микролитров спектиномицина и стрептомицина в инкубированную колбу. Раскачивайте колбу, чтобы равномерно смешать антибиотики в среду, прежде чем вернуть колбу в инкубатор.
Успешное размножение клеток Rickettsia parkeri и ISE6 дикого типа было очевидно окрашиванием Giemsa. Видны ядра клеток ISE6, окрашенных темно-фиолетовым цветом с Giemsa во внутриклеточных, а также во внеклеточных Рикеттси. Трансформация Rickettsia parkeri, экспрессирующего красный флуоресцентный белок в клетках ISE6, была подтверждена конфокальной микроскопией после семи дней инкубации.
Существенное увеличение уровня инфицирования наблюдалось через 10 дней. Держите все стерильным в течение всей процедуры. Обратите внимание на детали и будьте терпеливы, так как некоторым видам риккетсий требуется много времени для трансформации, особенно медленно растущим эндосимбионтам.
Этот протокол позволил изучить несколько аспектов биологии риккетсий и их взаимодействие с их членистоногими векторами и хозяевами млекопитающих. Например, флуоресцентные белки-экспрессирующие риккетси использовались для отслеживания подвижности и взаимодействия симбионтных клещевых клеток.
