Этот протокол позволяет увеличить количество нейронов в культурах ганглиев дорсальных корешков взрослых мышей. Это может помочь определить вклад нейронных клеток в данный ответ. Мы добавили этап иммунопанирования к базовому протоколу культивирования DRG.
Основным преимуществом является отбор против ненейрональных клеток. Если вы новичок в первичных культурах DRG, лучше всего практиковать вскрытие, чтобы получить как можно больше DRG и обрезать как можно больше нервов. Для начала аспирируйте поли-D-лизин, используемый для покрытия культуральной пластины, и трижды промойте пластину водой для культивирования тканей.
Откройте крышку и дайте поверхности полностью высохнуть. Нанесите достаточное количество ламинина на тарелку, чтобы покрыть дно каждой лунки, и поместите ее в инкубатор при температуре 37 градусов по Цельсию. Предварительно подготовленную посуду для промывки от CD45, PDGFR-бета и O4 вымойте D-PBS.
Для чашки CD45 добавьте 5 миллилитров 0,2% BSA и 20 микролитров первичного антитела CD45. Для чашки PDGFR-бета добавьте 15,2 микролитра PDGFR-бета в 5 миллилитров 0,2%-содержащей BSA пластины. Для чашки O4 добавьте 2 миллилитра гибридомы O4 к 3 миллилитрам 0,2% BSA и еще 100 микролитров 4% BSA, чтобы убедиться, что конечная концентрация BSA остается на уровне 0,2%Затем перфузируйте усыпленную мышь 30 миллилитрами 0,9% ледяного физиологического раствора.
Наблюдайте за изменением цвета печени, чтобы обеспечить перфузию. Прижмите переднюю и заднюю лапы к стадии пенополистирола и используйте чистое лезвие бритвы, чтобы обнажить позвоночник сзади. Выполните ламинэктомию, сделав разрезы примерно на полпути по обе стороны от дорсального позвоночника, удалив дорсальную половину столба, чтобы обнажить спинной мозг.
Либо аккуратно перережьте нервы и удалите спинной мозг, либо аккуратно отодвиньте спинной мозг в сторону, сохраняя целостность нерва. Под микроскопом для вскрытия используйте корешки спинномозговых нервов, чтобы найти и удалить все ганглии дорсальных корешков, или DRG, с обеих сторон позвоночника. Обрезайте нервный мусор из каждого DRG по мере его удаления, так как большее количество нервного мусора в культуре может привести к плохой выживаемости.
Соберите DRG в 15 миллилитров HBSS в коническую трубку на льду и дайте им осесть на дно. С помощью пипетки аспирируйте большую часть HBSS из DRG и оставьте примерно 100 микролитров жидкости в пробирке, чтобы избежать потери ткани. Трижды промыть 1 миллилитром HBSS и добавить в салфетку 5 миллилитров предварительно размороженного рабочего раствора STEMxyme.
Накройте крышку прозрачной пленкой и положите трубку на бок на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. После инкубации с ферментом добавьте в пробирку 1 миллилитр раствора ингибитора с низким содержанием овомукоидов. Аккуратно тритуируйте клетки пипеткой P1000 от 10 до 15 раз и дайте кусочкам ткани осесть.
Затем переведите верхние 2-3 миллилитра раствора, содержащего диссоциированные клетки, в свежий низкоовомукоидный раствор и повторяйте до тех пор, пока ткань полностью не диссоциирует и не останется видимых кусков. Центрифугируйте пробирку в течение 10 минут при 300 x g при комнатной температуре. После удаления надосадочной жидкости с помощью пипетки, как показано ранее, ресуспендируйте гранулу клетки в 1 миллилитре буфера для промывки и аккуратно перемешайте пипеткой.
Предварительно смочите 70-микрометровый сетчатый фильтр с 1 миллилитром буфера для промывки над конической трубкой объемом 50 миллилитров, а затем отфильтруйте раствор ячейки через сетчатое фильтро. Промойте тюбик 1 миллилитром буфера для промывки и пропустите его через ситечко. Для наслоения ячеек добавьте 2 миллилитра 15% BSA и аккуратно покройте стенки закрытой пробирки.
Чтобы удалить обломки миелина, аккуратно наложите клеточную суспензию по одному миллилитру за раз, пипеткой прижимая к стенке трубки поверх подушки BSA. Центрифугируйте пробирку при 300 x g в течение 10 минут при комнатной температуре, с медленным ускорением и замедлением. Средний миелиновый слой показывает чешуйки белого материала.
Используя пипетку P1000, удалите прозрачную жидкость сверху, миелиновую фазу между ними и BSA, по одному миллилитру за раз, оставив примерно 100 микролитров, чтобы не нарушить гранулу. Для извлечения антигена добавьте 5 миллилитров буфера для промывки и инкубируйте пробирку в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 10% углекислого газа в течение 30-45 минут. Затем трижды вымойте инкубированную посуду CD45 с помощью D-PBS и слейте последнее полоскание.
Затем вылейте клеточную суспензию в чашку CD45. Инкубируйте чашку в течение 20 минут при комнатной температуре, осторожно помешивая с 10-минутными интервалами, чтобы клетки получили равный доступ к антителам. Осторожно встряхните тарелку CD45 и подперите ее под углом.
Осторожно пипеткой нанесите 1 миллилитр клеточной суспензии на блюдо, чтобы собрать несвязанные клетки. Затем переложите его в чашку PDGFR-beta, предварительно трижды промытую D-PBS, и инкубируйте. Перенесите несвязанные клетки из чашки PDGFR-бета в чашку O4, как показано ранее, и инкубируйте тарелку.
После инкубации переложите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугу при 300 x g в течение 10 минут. Ресуспендируйте клетки в желаемом объеме и разбавьте до соотношения 1:1 трипановым синим для жизнеспособности клеток. С помощью гемоцитометра подсчитайте средние и крупные клетки.
Удалите ламинин и сразу же нанесите ячейки на нужную плотность, не давая им высохнуть перед инкубацией пластины. Фиксированные, цельные и иммунопанированные культуры DRG окрашивали бета3-тубулином для нейронов и DAPI для всех ядер. Было установлено, что целые культуры DRG имеют приблизительно 42,36% окрашивания бета3-тубулина, а иммунопанированные культуры DRG имеют приблизительно 71,44% окрашивание бета3-тубулина, что свидетельствует о значительном увеличении обогащения нейронов иммунопаннингом.
Очень важно бережно относиться к ткани. Очень важно помнить о бережном обращении с DRG, обрезке лишних нервов и заботе о том, чтобы не взволноваться и не потерять ткань и культуру.
