Этот протокол светоиндуцированного диэлектрофореза или LiDEP обеспечивает пошаговый метод характеристики мезенхимальных стволовых клеток человека. Этот метод может помочь дать ответы о гетерогенности образцов стволовых клеток. Преимуществом LiDEP является возможность вносить изменения в конфигурацию виртуального электрода в режиме реального времени в ответ на гетерогенность стволовых клеток, что невозможно для традиционных методов DEP.
Новый пользователь этого метода может столкнуться с трудностями при конденсации света проектора на микрожидкостном устройстве, чтобы создать виртуальный электрод. Мы бы посоветовали перенастроить установку, пока она не заработает. Помогать в демонстрации процедуры будет Зури Рашад, аспирант из моей лаборатории.
Для начала подготовьте микроканал, пробивая отверстия диаметром четыре миллиметра на двустороннем скотче примерно в пяти-шести миллиметрах от края более короткого размера и по центру между более длинными сторонами ленты. С помощью скальпеля отрежьте две прямые линии на расстоянии трех миллиметров друг от друга через отверстия, убедившись, что защитные листы на обеих сторонах ленты находятся на протяжении всей микроканальной резки. Отметьте все место моющимся маркером, убедившись, что просверленные отверстия совпадают с отверстиями, пробитыми в двустороннем скотче.
Эти два отверстия будут использоваться в качестве входного и выходного отверстий микрофлюидного устройства. Просверлите два отверстия диаметром три миллиметра в верхнем предметном стекле ITO. Затем поверх просверленного стекла с покрытием ITO поместите длинный край ленты, совмещенный с длинным краем стекла.
Снимите одну сторону защитной пленки с двустороннего скотча. Совместите отверстия ленты в верхнем предметном стекле ITO и аккуратно прижмите их друг к другу, удалив воздушные карманы, особенно возле микроканала. Снимите другую защитную пленку с двустороннего скотча.
Надавите на предметное стекло ITO с покрытием из молибдена и аморфного кремния, совпадает с краем фотопроводящего предметного стекла, противоположным стороне двухмиллиметрового зазора, с краем двусторонней ленты по направлению к центру верхнего предметного стекла ITO. Таким образом, между ITO и фотопроводящим слайдом ITO существует похмелье. Надавите на ровную поверхность, чтобы обеспечить хорошую адгезию, и отрежьте лишнюю ленту по бокам.
Чтобы подключить генератор функций, нанесите медную ленту на края слоя стекла ITO и слоя стекла ITO с фотопроводящим покрытием. Оберните ленту со стороны ITO или фотопроводящего материала от края двустороннего скотча примерно до трех сантиметров на сторону стеклянной подложки без покрытия. Чтобы обеспечить успешное изготовление устройства, используйте высотомер для проверки показаний сопротивления между предметными стеклами с покрытием обеих стеклянных подложек и медной лентой, прикрепленной к стеклу.
Добавьте 25 миллилитров сверхчистой воды в коническую трубку объемом 50 миллилитров, содержащую 4,25 грамма сахарозы и 0,15 грамма глюкозы. Хорошо перемешайте, пока половина сахарозы и глюкозы не растворится, и залейте сверхчистой водой до отметки 50 миллилитров. Затем энергично перемешайте этот буфер DEP до полного растворения.
Поместите 20 миллилитров приготовленного раствора сахарозы и глюкозы в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Добавьте в пробирку 0,1 грамма бычьего сывороточного альбумина, BSA. Хорошо перемешайте до тех пор, пока весь BSA не растворится, чтобы получить конечную концентрацию 0,5% BSA в буфере DEP.
Поместите один раз 10 в шесть мезенхимальных стволовых клеток человека или HMSC или эмбриональную почку человека, HEK293 суспендируют в одном миллилитре питательной среды в 10-миллилитровую центрифужную пробирку. Центрифуга, клетки HEK293 при 201 G в течение пяти минут и HMSC при 290 G в течение 10 минут. После центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость.
01 И осторожно ресуспендируйте клетки в одном миллилитровом буферном растворе DEP с 0,5% BSA. Повторите центрифугирование еще два раза и ресуспендируйте клетки в буфере DEP с 0,5% BSA. Подготовьте экспериментальную установку, такую как ноутбук, проектор, объектив, цифровой микроскоп и генератор функций для количественной оценки клеточных реакций на LiDEP.
Расположите объектив 10x, чип LiDEP и держатель поверх объектива проектора. Используйте ноутбук для создания световых проекций, таких как звезда, ромб, три линии и овал, и подключите ноутбук к проектору. Подключите микросхему LiDEP к генератору функций, чтобы подать электрическое поле переменного тока.
Чтобы наблюдать за клетками, испытывающими силу LiDEP, используйте цифровой микроскоп для визуализации записи NVIDIA. После завершения настройки промойте микроканал 70% этанолом, затем промывайте 0,5% раствором BSA, чтобы удалить этанол из предыдущих ячеек. Повторите промывку три раза, чтобы обеспечить полное смывание, так как клетки, ранее подвергшиеся воздействию поля DEP, будут реагировать иначе, чем свежие клетки, и могут нарушить сбор данных.
Удалите 0,5%-ный раствор BSA с помощью пипетки. Далее установите генератор функций на нужное напряжение и частоту. Осторожно добавьте 70 микролитров подготовленной клеточной суспензии в микроканал устройства с помощью меньшего наконечника пипетки, слегка наклонив его в отверстии к микроканалу, чтобы избежать просыпания из-за тонкости микроканала.
Сотрите раствор для доступа одноразовыми бумажными салфетками и выбросьте их в биологически опасные отходы. Затем спроецируйте нужные виртуальные круги электрогеометрии, ромбы, звезды или параллельные линии на чип LiDEP. В программном обеспечении цифрового микроскопа установите продолжительность видео на три минуты.
Установите лабораторный таймер на две минуты и 30 секунд. После того, как ячейки неподвижны в микроканале чипа LiDEP, нажмите кнопку «Пуск» в программном обеспечении цифрового микроскопа, чтобы начать процесс записи видео. Через 10 секунд нажмите кнопку «Вкл.» на выходе канала функционального генератора, чтобы подать электрическое поле переменного тока, и нажмите «Пуск» для таймера.
Контролируйте поведение DEP клетки с помощью цифрового микроскопа и предотвращайте тряску или движение по установке. Как только таймер погаснет, нажмите кнопку «Вкл.» на выходе канала функционального генератора, которая выключит выход канала, и электрическое поле переменного тока больше не подается через электроды. Остановите запись видео через три минуты и сохраните ее для будущего анализа.
Пипеткой вытащите ячейки из выходного конца микросхемы LiDEP, медленно проталкивая 60 микролитров буфера DEP с 0,5% BSA в микроканал и одновременно собирая выходное отверстие. Продолжайте до тех пор, пока в микроканале практически не останется клеток, и повторяйте DEP со всеми частотами, как показано на рисунке. Были определены ответы DEP с точки зрения скорости для HMSC и процента их жизнеспособности.
Измерения положительных откликов DEP при пяти, 10, 20 пиках напряжения до пика или VPP показали, что ячейки двигались со средней скоростью 0,025, 0,036 и 0,051 микрометра в секунду соответственно. Результаты жизнеспособности HMSC после испытания силы DEP показали, что более высокие напряжения обычно приводили к более низкой жизнеспособности клеток, при этом 57% клеток были жизнеспособны при 20 VPP. Для этого исследования были выбраны электроды белого, желтого, красного и синего цветов, но на освещение через чип глубины LiDEP влиял фотопроводящий слой, который имел красно-оранжевый цвет.
Следовательно, проецируемый белый электрод казался желтым с белой внутренней частью, красный электрод казался оранжевым с красным контуром, а синий электрод казался светло-зеленым. Это явление говорит о том, что желтый и белый цвета имели самое сильное поле DEP, в то время как синий и красный были слабее. Реакцию DEP HMC измеряли с помощью LiDEP в трех анализаторах глубины при 10 VPP.
При LiDEP наблюдался спад положительного ответа DEP с 30 килогерц до 20 мегагерц. Из трех анализаторов клетки увеличили положительный DEP с 37 до 255 килогерц и уменьшили положительный DEP с 1 772 килогерц до 20 мегагерц. Двумя важными компонентами в этом методе являются сильный источник света и прочное электрическое соединение для обеспечения создания электрического поля и манипуляций с ячейками.
Мы наблюдали вращение клеток в ответ на виртуальные электроды. Таким образом, электровращение является еще одним методом анализа клеток, который может быть выполнен. Электроротация предоставит информацию о гетерогенности HMSC и редких субпопуляциях.
